Quantification of eight antimycotics in human plasma by LC-HRAM-MS for clinical research

Význam tématu

Správné dávkování a monitorování antivirotických látek je klíčové pro úspěšnou léčbu těžkých plísňových infekcí, zejména u imunosuprimovaných pacientů. Různá biologická variabilita a interakce vedou k odlišným plazmatickým koncentracím i při stejném režimu podání. Vysoce rozlišená hmotnostní spektrometrie (HRAM-MS) nabízí výhody v selektivitě a zkrácení času až o desítky procent oproti tradičním HPLC-UV metodám.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout a validovat rychlou a citlivou LC-HRAM-MS metodu pro simultánní kvantifikaci osmi antimykotik ve vzorcích lidské plazmy. Metoda byla implementována na platformě Thermo Scientific, s důrazem na jednoduchou přípravu vzorku, krátkou dobu analýzy (3,6 min) a plnění klinicky relevantních parametrů přesnosti, linearity a opakovatelnosti.

Použitá metodika

Vzorky: 50 µl lidské plazmy bylo denaturováno 100 µl acetonitrilu obsahující interní standardy. Po vortexování a odstředění byl supernatant ředěn vodou na 500 µl a podán na kolonu.

Chromatografie: Vanquish Flex Binary UHPLC; kolona Hypersil GOLD 50 × 2,1 mm, 1,9 µm při 40 °C; mobilní fáze A voda + 0,1 % kyseliny mravenčí, B acetonitril + 0,1 % kyseliny mravenčí; gradient 3,6 min, průtok 0,5 ml·min–1, injekce 2 µl.

Detekce: Orbitrap Exploris 120 s HESI v pozitivním režimu; full scan ddMS2 (100–750 m/z), rozlišení 60 000, kolizní energie 30 %; data zpracována v TraceFinder 5.1.

Hodnocení metody: linearita (korel. koeficient > 0,99), přesnost (% bias ±15 %), opakovatelnost intra‐ a inter‐denní (%CV ≤ 8,4 %), žádné pozorovatelné přenášení (carryover).

Použitá instrumentace

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Flex Binary
• Hmotnostní spektrometr: Thermo Scientific Orbitrap Exploris 120
• Kolona: Thermo Scientific Hypersil GOLD 50 × 2,1 mm, 1,9 µm
• Software: Thermo Scientific TraceFinder 5.1
• Kalibrátory a kontrolní vzorky: RECIPE ClinMass LC-MS/MS

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala výbornou linearitu napříč stanovenými koncentracemi pro všech osm látek. Bias mezi nominálními a zjištěnými hodnotami se pohyboval v rozsahu –7,6 % až +7,2 %. Intra-denní opakovatelnost byla vždy pod 8,4 %, inter-denní pod 5,8 %. Analýza trvá pouze 3,6 min, bez potřeby komplexních extrakčních postupů.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza šetří čas a náklady na chromatografii i přípravu vzorku.
• Vyšší selektivita a spolehlivost detekce oproti UV metodám.
• Možnost simultánního stanovení více antimykotik v jednom běhu.
• Vhodné pro terapeutické monitorování (TDM) a klinický výzkum.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit o další farmakologicky významné látky a adaptovat na workflow automatizované přípravy vzorků. Implementace mikroproudové LC a online SPE by mohla dále zefektivnit spotřebu rozpouštědel a zkrátit čas. Integrace s klinickými informačními systémy umožní on‐line TDM a personalizovanou terapii.

Závěr

Navržená LC-HRAM-MS metoda poskytuje robustní, rychlý a reprodukovatelný nástroj pro simultánní kvantifikaci osmi antimykotik v lidské plazmě. Splňuje kritéria pro klinický výzkum a nabízí výhody v citlivosti i selektivitě.

Reference

Renoulin G., Barcenas M., De Nardi C. Quantification of eight antimycotics in human plasma by LC-HRAM-MS for clinical research. Technical Note 66046, Thermo Fisher Scientific, 2021.