Adeno-Associated Virus Host Cell Protein Profiling Using Micro-flow Separation on a UHPLC-HRAM MS Platform

Význam tématu

Rekombinantní adeno-asociované vektorové částice (rAAV) jsou klíčové v genové terapii díky vysoké účinnosti a bezpečnosti. Hostitelské buněčné proteiny (HCP) představují hlavní procesní kontaminanty, které musí být během výroby a čištění vektorů důkladně kontrolovány. Rozvoj citlivých a robustních analytických metod pro jejich identifikaci a kvantifikaci zajišťuje kvalitu a bezpečnost finálních AAV produktů.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a ověřit LC-MS/MS postup s mikroprůtokovou separací pro identifikaci a relativní kvantifikaci HCP v surovém a čištěném vzorku AAV6. Studie srovnala počet a koncentraci HCP před a po afinitní purifikaci pomocí POROS AAVX pryskyřice a ověřila reprodukovatelnost výsledků.

Použitá metodika

Vzorky surového a purifikovaného AAV6 byly redukovány, alkylovány a trávěny trypsinem. Peptidové směsi byly analyzovány mikroprůtokovým UHPLC separátorem Vanquish Horizon s kolonou PepMap 100 C18 (1,0×150 mm, 3 µm) při 50 °C a 80 µl/min. Systém byl napojen na Orbitrap Exploris 480 MS, data sbírána v režimu závislého sběru MS/MS. Identifikace HCP probíhala v Biopharma Finder 5.0 proti databázi Human-uniprot-proteome doplněné o sekvenci Streptococcus proteinu.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Horizon
• Kolona: Thermo Scientific PepMap 100 C18, 1.0×150 mm, 3 µm
• MS: Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480
• Softwarové prostředí: Thermo Scientific Biopharma Finder 5.0 s HyperBridge konektivitou

Hlavní výsledky a diskuse

Ve surovém AAV6 vzorku bylo identifikováno téměř 1000 HCP (min. 3 unikátní peptidy). Po purifikaci vzorku počet HCP klesl na 30, což dokládá vysokou účinnost afinitní pryskyřice POROS AAVX. Metoda dosáhla vysoké reprodukovatelnosti retenčních časů a integrovaných plošných hodnot peptidů (CV ~11 %). Nízkou koncentrací obsažené HCP byly spolehlivě detekovány a kvantifikovány v širokém dynamickém rozsahu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Vysokou citlivost díky mikroprůtokové separaci a výkonnému zdroji MS
• Robustní a reprodukovatelné výsledky retenčních časů a kvantifikace
• Možnost podrobné charakterizace HCP v komplexních humaních matricích
• Snadné sdílení a spolupráci díky cloudovým reportům v Biopharma Finder

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj adaptivních algoritmů pro zpracování dat, vyšší integrace do výrobního prostředí a rozšíření databází HCP pro různé buněčné linie. Kombinace s novými zdroji iontů a kolaborativními cloudovými platformami umožní rychlejší analýzy a lepší kontrolu kvality bioterapeutik.

Závěr

Vyvinutá mikroprůtoková UHPLC-HRAM MS/MS metoda pro analýzu AAV HCP prokázala vysokou citlivost, selektivitu a reprodukovatelnost. Účinně odlišuje a kvantifikuje široké spektrum HCP jak ve surových, tak v purifikovaných vzorcích AAV6, čímž poskytuje cenný nástroj pro kontrolu kvality genových terapií.

Reference

Žádné externí literární zdroje uvedeny.