Multi-site assessment of precision and reproducibility of high-throughput capillary-flow LC-MS proteome profiling with novel ultra-high-pressure LC coupled to HRAM MS

Význam tématu

Analýza proteomu vyžaduje metody kombinující vysokou citlivost, rychlost a reprodukovatelnost. Vysokoprůtokové kapilární LC-MS postupy představují klíč k masivnímu zpracování vzorků v proteomice, zejména při rozsáhlých studiích kvality QC nebo klinických kohort.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo ověřit mezilaboratorní i intralaboratorní přesnost a reprodukovatelnost protokolů pro bottom-up proteomické profilování využívajících nový systém Vanquish Neo UHPLC coupled s Orbitrap Exploris 480 MS. Vyvinuté metody umožňují zpracování 24 až 180 vzorků za 24 hodin se zachováním vysoké využitelnosti hmotnostního spektra až 95 %.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorková příprava:

• Digestion směs HeLa/PRTC standard (Pierce HeLa Digest/PRTC, 10 µg/vial) rekonstituována 0,1 % FA.

Parametry LC-MS:

• Vanquish Neo UHPLC systém pro nano-, kapilární a mikroprůtoky.
• Kolona EASY-Spray PepMap Neo 75 µm × 150 mm, 2 µm částice.
• Orbitrap Exploris 480 HRAM MS, trap-and-elute workflow.
• Různé rychlé gradienty pro 24, 30, 60, 100 a 180 vzorků/24 h.

Dataová analýza:

• Proteome Discoverer 2.5 se Sequest HT a INFERYS rescoring.

Hlavní výsledky a diskuse

Produktivita a standardizace:

• Metody s celkovým cyklem 14,4 až 60 min poskytly úzké chromatografické píky (FWHM 2–11 s) a až 82 % MS využití díky paralelní separaci a přípravě kolony.

Reprodukovatelnost:

• Intrakolonová RSD počtu identifikovaných peptidů a proteinů < 2 % u jedné kolony.
• Interkolonová RSD < 6 % při použití tří sad kol, nezávisle na laboratorním pracovišti.
• Stabilita retenčních časů PRTC peptidů přes 100 injekcí (14,4 min metoda).
• Mezilaboratorní společné identifikace proteinů > 72 % napříč třemi pracovišti pro všechny metody.

Přínosy a praktické využití metody

Díky vysoké propustnosti a reprodukovatelnosti lze tuto soustavu využít pro:

• Velkokapacitní proteomické studie v akademii i průmyslu.
• Pravidelné QA/QC analýzy a monitorování biologických kohort.
• Rychlé screeningové aplikace a biomarkerové studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Integrace s automatizovanými přípravami vzorků a AI-řízenou analýzou dat.
• Další snížení doby cyklů při zachování oddělovací výkonnosti.
• Využití v multi-omics workflow propojujících proteomiku, metabolomiku a lipidomiku.

Závěr

Systém Vanquish Neo UHPLC spolu s PepMap Neo kolonnou a Orbitrap Exploris 480 MS umožňuje rychlé, citlivé a vysoce reprodukovatelné LC-MS proteomické profily. Metody poskytují špičkovou propustnost až 180 vzorků/24 h a konzistentní výsledky napříč laboratořemi, což podporuje jejich široké uplatnění v rozsáhlých proteomických projektech.

Reference

1. Zheng R., Arrey T., Hakimi A., Pynn C., Woodmansey K., Valenta A., Meding S., Samonig M., Boychenko O. Multi-site assessment of precision and reproducibility of high-throughput capillary-flow LC-MS proteome profiling with novel ultra-high-pressure LC coupled to HRAM MS. Thermo Fisher Scientific; 2021.