Automated Dual Metabolite+Lipid Cell Sample Prep as a Component of an LC/HRMS-based Workflow to Elucidate the Molecular Response to Drug Treatment

Význam tématu

Automatizovaná příprava vzorků pro současnou extrakci polarních metabolitů a lipidů z buněk přináší významné zlepšení efektivity a konzistence v oblasti buněčné metabolomiky a lipidomiky. Tato metoda zajišťuje rychlé záchlazení a lýzu buněk za pokojové teploty, čímž minimalizuje změny v metabolickém profilu během přípravy.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na vývoj a ověření automatizovaného postupu pro sekvenční extrakci metabolitů a lipidů z jediné vzorku lidských leukemických buněk (linie K562). Systém byl použit k analýze molekulární odpovědi na léčivo methotrexát (MTX) pomocí LC/HRMS a softwarových nástrojů pro neznámou (untargeted) analýzu.

Použitá metodika a instrumentace

Buňky K562 kultivované v RPMI byly ošetřeny 1 µM MTX nebo vehikulem po dobu 24 h. Lýza a zastavení metabolismu probíhala při pokojové teplotě pomocí 50% trifluoroetanolu ve vodě. Pro hodnocení výtěžnosti byly přidány standardy 13C-metabolitů a 2H-lipidů. Extrakce byla plně automatizována na platformě Agilent Bravo Liquid Handling.

Oddělovací a analytické kroky:

• Reverzní fázová LC (+/-) pro lipidy a iontově párující RP-LC (-) pro polaritu.
• Analýza na Agilent 6546 LC/Q-TOF.
• Softwarové nástroje: MassHunter Quantitative Analysis, Profinder, Lipid Annotator, Mass Profiler Professional (MPP), METLIN spektrální knihovna.

Hlavní výsledky a diskuse

Obnova sloučenin:

• Polarické metabolity: 87 % sloučenin s výtěžností 90–110 %, průměrný RSD 5.9 % (93 % <10 %).
• Lipidy: různé objemy spike-in, průměrný RSD 6.4 %, všechny třídy lipidů <10 %.

Nefiltrovaná analýza odhalila cca 4700 rysů, z nichž 458 vykázalo statistickou významnost (≥1.5násobná změna, p<0.05). Shluková analýza ukázala ovlivnění purinové a pyrimidinové biosyntézy, aminokyselinového i TCA cyklu. Lipidomika pomocí iterativního MS/MS umožnila anotovat klíčové lipidy.

Více-omická korelační analýza v MPP odhalila silnou pozitivní korelaci L-serinu s vybranými ceramidy (r=0.92), což naznačuje propojení mezi MTX vlivem na serinovou cestu a biosyntézu ceramidů. MTX vedl k nárůstu ceramidů a acylkarnitinů a poklesu krátkých fosfatidylinositolů s akumulací prekurzorů v purinové/pyrimidinové dráze.

Přínosy a praktické využití metody

• Kompatibilita s automatizací a vysokou propustností.
• Jednotná extrakce metabolomiky a lipidomiky z jednoho vzorku zabraňující variability.
• Možnost přímé multi-omické integrace pro hlubší biologickou interpretaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Důsledná integrace s dalšími omickými platformami (proteomika, transkriptomika).
• Rozšíření do klinické analýzy a personalizované medicíny.
• Další automatizace celého workflow včetně bunkové kultivace a dávkování činidel.
• Využití v QA/QC laboratořích a farmaceutickém výzkumu pro rychlé hodnocení účinků léčiv.

Závěr

Vyvinuté workflow propojuje extrakci metabolitů a lipidů v rámci jediné automatizované procedury a poskytuje konzistentní, vysoce reprodukovatelné výsledky. Platforma umožňuje komplexní neznámou analýzu a odhaluje detailní molekulární změny při léčbě methotrexátem.

Reference

1. Spivia W et al. Automated Metabolite Extraction for Plasma using the Agilent Bravo Platform. Agilent Application Note 5994-0685EN, 2019.
2. Apffel A et al. A Novel Solid Phase Extraction Sample Preparation Method for Lipidomic Analysis of Human Plasma. Metabolites 2021;11(5):294.
3. Funk RS et al. Metabolomic Profiling to Identify Molecular Biomarkers of Cellular Response to Methotrexate In Vitro. Clin Transl Sci 2020;13(1):137-146.