An Automated, Combined Workflow for Extracting Polar Metabolites and Lipids from Mammalian Cells

Význam tématu

Analytická příprava vzorků z buněk savců je klíčová pro spolehlivé výsledky v metabolomice a lipidomice. Konvenční metody vyžadují rychlé ochlazení tekutým dusíkem a ruční separaci fází, což je složité, časově náročné a náchylné k chybám. Integrovaný, částečně automatizovaný postup umožňuje získat polarní metabolity i lipidy z jednoho vzorku rychleji, bezpečněji a s vyšší reprodukovatelností.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a ověřit workflow pro současnou extrakci polarních metabolitů a lipidů z buněk savců za pokojové teploty a jeho automatizaci. Studie porovnává novou metodu s tradičním chlazeným protokolem, hodnotí výtěžnost, stabilitu klíčových metabolitů (např. ATP) a kvalitu lipidových extraktů.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow zahrnuje:

• Lyzi buněk a metabolickou inaktivaci při pokojové teplotě v 50% trifluoroetanolu (TFE).
• SPE materiál Captiva EMR-Lipid pro zachycení proteinové matrice a následnou separaci polarních metabolitů v průtokové frakci.
• Sekvenční eluce lipidů z téže SPE destičky.
• Automatizaci celého postupu na pracovním stanovišti Bravo Liquid Handler.

Instrumentace pro analýzu:

• Agilent 6545 LC/Q-TOF s iontovodivým iontovým párováním pro kvantifikaci polarních metabolitů.
• MassHunter VistaFlux a Quant 10.1 pro zpracování stabilně značených dat.
• Reverzní fázová LC/Q-TOF v negativním režimu kombinovaná s Lipid Annotator 1.0 a Mass Profiler Professional 15.1 pro analýzu lipidů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Izotopové sledování 13C-glutaminu potvrdilo, že TFE za pokojové teploty efektivně zastaví metabolismus bez enzymatické konverze glutaminu na glutamát.
• Stabilita ATP ve 50% TFE je zachována po dobu minimálně 4 hodin, s výtěžností srovnatelnou s tradičním chlazeným protokolem.
• Při SPE extrakci polarních metabolitů byly dosaženy vysoké výtěžnosti organických kyselin, aminokyselin, cukrů a nukleotidů z 13C-standardů.
• Lipidomická analýza identifikovala 225 lipidových anotací ve 21 třídách, přičemž výsledky byly konzistentní napříč čtyřmi replikáty a porovnatelné s klasickou extrakcí.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace potřeby práce s tekutým dusíkem zjednodušuje manipulaci a zvyšuje bezpečnost.
• Jedna SPE destička umožňuje získat data pro multi-omics analýzu ze stejného vzorku.
• Automatizace snižuje riziko lidských chyb a zlepšuje reprodukovatelnost výsledků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření workflow na vysokopropustné platformy a další typy buněčných kultur.
• Integrace s dalšími analytickými technologiemi (proteomika, glykomika) pro komplexní multi-omics přístup.
• Vývoj nové generace SPE materiálů pro širší škálu molekulárních tříd.

Závěr

Navržený semi-automatizovaný postup pro extrakci polarních metabolitů a lipidů z buněk savců za pokojové teploty nabízí bezpečnější, rychlejší a reprodukovatelnější alternativu k tradičnímu chlazenému protokolu. Validace stabilní izotopovou metodikou a rozsáhlá lipidomická analýza potvrdily jeho spolehlivost pro multi-omics aplikace v biomedicínském výzkumu a průmyslové kvalitě.

Reference

1. Hartman T. E. et al. Agilent Technologies Application Note (2017)
2. Zhao L. et al. Agilent Technologies Application Note (2017)
3. Matyash V. et al. J Lipid Res 49, 1137–1146 (2008)