Rapid Analysis of mRNA 5’-Capping with High-Resolution LC-MS

Význam tématu

V posledních letech nabyla průmyslová výroba mRNA na významu, zejména v souvislosti s vývojem vakcín a terapeutik. K úspěšné translaci mRNA do proteinů je nezbytná 5’-capping modifikace, která zajišťuje stabilitu a účinnost molekul. Přesná charakterizace a kvantifikace 5’-cap struktury je proto klíčovou kvalitou produktu v biotechnologiích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlou a spolehlivou LC-MS metodu pro analýzu 5’-capping mRNA během 75 minut celkové doby analýzy. Metoda kombinuje řízené uvolnění krátkých oligonukleotidů z koncového úseku mRNA pomocí termostabilního RNase H s vysoce rozlišenou chromatografií a hmotnostní spektrometrií.

Použitá metodika a instrumentace

• Transkripce mRNA (~3800 nt) s ko-transkripčním cappingem ARCA nebo enzymatickým cappingem pomocí Vaccinia capping enzymu
• Fragmentace 5’-koncového úseku mRNA pomocí termostabilního RNase H a 15nt chimerického propu navázaného na místo řezu
• Termostabilní RNase H: 50 °C, 30 min pro specifickou štěpnou reakci bez off-target produktů
• Čištění a separace uvolněných oligonukleotidů pomocí IP-RP LC na AdvanceBio Oligonucleotide kolóně (2,1×50 mm, 2,7 μm) s mobilní fází H2O/MeOH, 25 mM HFIP, 15 mM dibutylamin
• Detekce na Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF a analýza dat v softwaru MassHunter BioConfirm 10.0
• Vizualizace štěpných produktů pomocí Agilent 2100 Bioanalyzer

Hlavní výsledky a diskuse

• Termostabilní RNase H eliminoval nežádoucí vedlejší fragmenty pozorované při 37 °C a zkrátil celkovou dobu přípravy vzorku
• IP-RP LC-MS efektivně oddělila 5’-oligonukleotidy s různými capping stavy (triphosfát, difosfát, ARCA cap, Cap 0)
• Deconvoluce hmotových spekter potvrdila identitu uvolněných oligonukleotidů s přesností < 10 ppm
• Metoda prokázala vynikající linearitu kvantifikace poměru cap struktur v rozmezí 8–80 % (R2 = 0,9999) a mezní dolní kvantifikační limit ≈ 8 %
• Opakovatelnost měření poměru cap struktur se pohybovala kolem 10 % RSD, retence oligonukleotidů byla reprodukovatelná s 1–1,5 % RSD
• Optimální poměr složek cappingové reakce s Vaccinia enzymem zvýšil účinnost enzymatického cappingu z 2,6 % na 32,9 %

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a rutinní kontrola kvality mRNA ve výrobním a výzkumném prostředí
• Možnost sledování jednotlivých intermediátů cappingu a sekvenčních variant způsobených transkripční chybou
• Podpora optimalizace výrobního procesu a enzymatických reakcí v reálném čase
• Automatizovatelnost a kompatibilita se standardními softwarovými nástroji pro hmotnostní spektrometrii

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na analýzu dalších modifikací 5’-cappingu (Cap1, Cap2)
• Integrace s vysoce výkonnými choreografií a automatizovanou přípravou vzorků pro vyšší propustnost
• Využití ve vývoji nové generace mRNA vakcín a terapeutik
• Standardizace metody pro regulační účely a mezilaboratorní studie

Závěr

Studie představuje efektivní LC-MS platformu pro kvantitativní analýzu 5’-cappingu mRNA. Díky optimalizované přípravě vzorku a vysoce rozlišené hmotnostní spektrometrii je metoda schopna rychle identifikovat a kvantifikovat různé cap formy a usnadňuje vývoj procesů v biotechnologické výrobě.

Reference

• KJ Hassett et al, Mol. Ther. Nucleic Acids, 2019, 15, 1–11
• M Beverly et al, Anal. Bioanal. Chem., 2016, 408, 5021–5030
• A L Fuchs et al, RNA, 2016, 22, 1454–1466