Characterization of Antibody Drug Conjugates (ADC) using 2-Dimension Liquid Chromatography (2D-LC) and Native Mass Spectrometric Technologies

Význam tématu

Antibody-drug conjugáty (ADC) představují rychle se rozvíjející třídu biologicky aktivních molekul kombinujících monoklonální protilátky s cytotoxickými léčivy. Klíčovým parametrem ovlivňujícím účinnost a bezpečnost ADC je poměr počtu navázaných moleculek léčiva na jednu protilátku, tzv. DAR (drug-to-antibody ratio). Přesná charakterizace tohoto parametru včetně zachování nativní struktury molekul je zásadní pro vývoj, kontrolu kvality a registraci ADC produktů.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo navrhnout a demonstrovat novou dvoudimenzionální kapalinovou chromatografii (2D-LC) spojenou s nativní hmotnostní spektrometrií pro komplexní analýzu intactních ADC vzorků. Studie se zaměřila na:

• Oddělení variant ADC s různými DAR hodnotami pomocí hydrofobní interakční chromatografie (HIC),
• On-line přepojení s velikostně vylučovací chromatografií (SEC) za nativních podmínek,
• Přímou detekci intactních molekul ADC a stanovení jejich hmotnosti a DAR z nativních MS spekter.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika kombinovala dva chromatografické stupně s nativním režimem MS:

• 1. dimenze: hydrofobní interakční chromatografie (AdvanceBio HIC, 4,6×100 mm, 3,5 µm) pro frakcionaci podle DAR,
• 2. dimenze: velikostně vylučovací chromatografie (AdvanceBio SEC, 4,6×300 mm, 1,9 µm) pro desalinaci a zachování nativní struktury,
• Detekce: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s rozšířeným rozsahem až m/z 30 000 v kombinaci s softwarem MassHunter LC/MS Data Acquisition 11.0 a BioConfirm 11.0.

Hlavní výsledky a diskuse

HIC separace odhalila frakce s DAR hodnotami 0, 2, 4, 6 a 8. Při denaturačních podmínkách (reverzní fáze) se objevily četné produkty degradace ADC a rozpad mAb řetězců. Naproti tomu nativní 2D-LC/MS analýza zachovala integritu molekul, umožnila přímou dekonvoluci MS spekter a přesné stanovení DAR pro jednotlivé frakce. Byl prokázán vysoký poměr signál/šum i pro nízké DAR varianty a minimální artefakty degradace.

Přínosy a praktické využití metody

Dvoufázový nativní přístup přináší několik výhod:

• Přesné a reprodukovatelné stanovení průměrné DAR hodnoty intactních ADC,
• Zachování nativního konformace protilátkových komplexů,
• Komplexní on-line separace bez nutnosti odběrů do sběrných nádob,
• Možnost integrace do kvality výroby a výzkumných workflow pro rychlou kontrolu stability a homogenity vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj lze očekávat v oblasti vysokorychlostních 2D-LC systémů, plné automatizace frakcionace a integrované datové analýzy s využitím strojového učení. Rozšíření metodiky na různé typy vazeb linkera a ADC formáty umožní širší aplikaci v preklinickém i klinickém vývoji biologických léčiv.

Závěr

Navržená 2D-LC/native MS metodika poskytuje robustní platformu pro detailní charakterizaci intactních ADC. Umožňuje přesné stanovení DAR, minimalizuje artefakty degradace a otevírá cestu k efektivnímu nasazení v průmyslové a regulační praxi.

Reference

1. Ross P. L. et al. Physical and Chemical Stability of Antibody Drug Conjugates: Current Status. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2016;105:391–397.
2. Agilent Technologies. High Salt – High Reproducibility: Analysis of antibody drug conjugates using hydrophobic interaction chromatography with the Agilent 1290 Infinity II Bio LC System. Application Note 5994-2691EN, 2020.
3. Agilent Technologies. Sensitive Native Mass Spectrometry of Macromolecules Using Standard Flow LC/MS. Application Note 5994-1739EN, 2020.