Multi-Target Screening and Quantitation of 24 Drugs in Blood, Serum and Urine Using Automated Sample Preparation Coupled Directly to LC-MS/MS

Význam tématu

Forenzní toxikologie vyžaduje spolehlivou a rychlou identifikaci a kvantifikaci léčiv a drog v biologických matricích. Tradiční extrakční postupy (SPE, LLE) jsou náročné na čas a náchylné k chybám obsluhy. Plně automatizované vzorkové přípravy spojené s moderní LC-MS/MS technologií významně zvyšují laboratorní propustnost, reprodukovatelnost a bezpečnost práce.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl vyvinout a validovat metodu pro současný screening a kvantifikaci 24 běžně zneužívaných látek v krevním séru, plné krvi a moči. Hlavní body:

• Implementace integrovaného automatického modulu CLAM-2030 pro vzorkovou přípravu.
• Bezprostřední napojení přípravy na Shimadzu LCMS-8060 pro vícečetné MRM měření.
• Validace dle ANSI/ASB Standard 036 – stanovení LOD 10 ng/mL, rozsah kvantifikace 10–1000 ng/mL.

Použitá metodika

Vzorky byly připraveny plně automaticky v CLAM-2030 module:

• Navlhčení PTFE filtru vodou, přidání interních standardů.
• Naředění fyziologickým roztokem (1:5), precipitace proteinů metanol-acetonitrilovým roztokem.
• Míchání (30 s, 2000 rpm) a vakuová filtrace (60 s).
• Přímý přesun filtrátu do autosampleru LCMS-8060.

Chromatografické podmínky: gradientní eluce 17 min, biphenylová kolona Raptor Biphenyl (2,1 × 100 mm, 2,7 µm), mobilní fáze A: 0,1 % kyseliny mravenčí + 10 mM amonium formiát ve vodě, B: 0,1 % kyseliny mravenčí + 10 mM amonium formiát v methanolu, průtok 0,3 mL/min, teplota kolony 50 °C.

Použitá instrumentace

• CLAM-2030: automatizovaný modul pro vzorkovou přípravu (ředění, precipitace, filtrace).
• Shimadzu LCMS-8060: triple quadernární hmotnostní spektrometr s ESI v pozitivním a negativním režimu, MRM a funkcí Synchronized Survey Scan.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožňuje snížení doby vzorkové přípravy z více než 2 hodin na přibližně 5 minut. Validace prokázala:

• LOD a LOQ 10 ng/mL pro všechny analyty.
• Lineární kalibrace 10–1000 ng/mL s R2 ≥ 0,990 (výjimky naproxen a heroin).
• Bias a přesnost ≤ 20 % při 80, 400 a 800 ppb (s výjimkou několika látek).
• Žádný carry-over ani rušení matricemi či interními standardy.

Analýza sedmi postmortem vzorků (plná krev, sérum, moč) v trojím opakování vykázala %RSD < 20 % a průměrné odchylky od referenčních hodnot < 20 %. Identifikace prostřednictvím knihovny s cutoff skóre 80 zajistila nulové falsenegativní či false-pozitivní nálezy.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší významné výhody:

• Výrazné zrychlení a zjednodušení pracovních postupů.
• Snížení variability výsledků a eliminace chyb obsluhy.
• Zvýšení laboratorní bezpečnosti díky minimalizaci manuálních operací.
• Rychlá integrace standardizované databáze Forensic Toxicology Database.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat:

• Rozšíření počtu analyzovaných látek a adaptace na nové drogy.
• Využití vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie pro neznámé vzorky.
• Implementaci umělé inteligence pro pokročilé vyhodnocení MS/MS spekter.
• Integraci s on-line systémy pro okamžité forenzní vyšetření na místě.

Závěr

Plně automatizované spojení CLAM-2030 a LCMS-8060 představuje efektivní a spolehlivý nástroj pro vysokoprůtokový screening a kvantifikaci drog v biologických matricích. Metoda nabízí rychlost, reprodukovatelnost a bezpečnost, což odpovídá nárokům moderní forenzní toxikologie.

Reference

1. Analysis of Postmortem Samples Using Automated Sample Preparation Coupled Directly to LC-MS/MS, Shimadzu Scientific Instruments, 2019.