VYUŽITÍ COULOMETRICKÉHO DETEKTORU COULARRAY PRO ANALÝZU PŘÍRODNÍCH ANTIOXIDANTŮ

Význam tématu

Analýza přírodních antioxidantů, zejména fenolických látek a flavonoidů, je v potravinářské a farmaceutické praxi klíčová pro hodnocení nutriční kvality, stability a biologické aktivity výrobků. Přesná a citlivá stanovení umožňují sledovat antioxidační potenciál, optimalizovat výrobní postupy a zajišťovat kvalitu konečného produktu.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout a optimalizovat metodu vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC) s multielektrodovým coulometrickým detektorem CoulArray pro kvantitativní a selektivní stanovení vybraných přírodních antioxidantů v pivních vzorcích. Studie obsahovala optimalizaci chromatografických podmínek, kalibraci metody, porovnání citlivosti s dalšími detektory a aplikaci na 40 vzorků českých i zahraničních piv.

Použitá instrumentace

• HPLC systém Shimadzu LC-10AD PV a ESA model 582
• Kolona Zorbax SB C18, 2,1 × 150 mm, 5 µm
• CoulArray detektor ESA model 5600A s osmi průtočnými buňkami
• Potentialy elektrod: 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mV
• Teplota kolony a detektoru: 36 °C
• Ultrazvuková lázeň, filtrace vzorků skrz membránu 0,2 μm

Použitá metodika

Vzorky piv byly pouze rekuperovány ultrazvukem, zředěny mobilní fází a filtrovány, bez chemické extrakce.
Gradientní eluce dvousložkovou mobilní fází:

• Fáze A: 5 mM octan amonný/pH 3,15 + 3 % acetonitril
• Fáze B: 5 mM octan amonný/pH 3,15 + 50 % acetonitril
• Gradient: 100 % A (0–30 min), 4 % B (30–35 min), 14–30 % B (35–50 min), 30–60 % B (50–75 min), 60 % B (75–85 min)
• Průtok: 0,23 ml·min⁻¹, objem injekce 20 µl

Kvantifikace probíhala pomocí kalibračních křivek v rozpětí 1×10⁻³–1 mg·l⁻¹, lineárních s korelačními koeficienty > 0,995.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizací pH (nejlepší rozlišení při pH 3) a průtoku bylo dosaženo dostatečného rozlišení i u kritických dvojic fenolů. Metoda umožnila meze detekce CoulArray detektoru v rozsahu 1×10⁻³ až 5×10⁻² mg·l⁻¹, což je o řád lepší než u dvouelektrodového Coulochem II a o tři čtyři řády lepší než u fluorescenční detekce (u látek s vlastním fluorescenčním signálem). Analýza 40 piv ukázala odlišné spektrum a průměrné koncentrace antioxidantů v českých a zahraničních vzorcích: česká piva vykazovala vyšší obsah katechinu, kyseliny protokatechuové, kávové a sinapové, zahraniční piva byla bohatší na kyselinu vanilovou, vanilin a kumarovou.

Přínosy a praktické využití metody

• Velmi vysoká citlivost a selektivita i v komplikovaných matricích bez nutnosti složité úpravy vzorku
• Kompatibilita s gradientní elucí umožňuje jednorázové stanovení širokého spektra antioxidantů
• Identifikace na základě retenčních časů a poměrů signálů na různých elektrodách
• Stabilní signál i při částečné pasivaci elektrod

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření metody na další potravinové a biologické matrixy, integrace s hromadnou spektrometrií pro strukturalizaci nových sloučenin, miniaturizace coulometrického detektoru, vývoj automatizovaných protokolů pro průmyslový monitoring kvality a sestavování databází „elektrochemických otisků“ látek pro strojové učení.

Závěr

Vyvinutá HPLC–CoulArray metoda pro analýzu přírodních fenolických antioxidantů poskytuje vynikající citlivost, selektivitu a robustnost a eliminuje náročné úpravy vzorku. Metoda byla úspěšně aplikována na široké spektrum pivních vzorků a prokázala schopnost odlišit jejich antioxidantové profily.

Reference

1. Ho C.-T., Lee C.Y., Huang M.-T.: ACS Symp. Ser. 506, 402 (1992).
2. Pospíšil J.: Antioxidanty. Academia, Praha 1968.
3. Gamache P.H. a kol.: Progress in HPLC-HPCE: Coulometric Electrode Array Detectors for HPLC, VS Press, Amsterdam 1997.
4. Acworth I.N., Gamache P.H.: Am. Lab. 5, 33 (1996).
5. Swendsen C.: Analyst 118, 123 (1993).
6. Hayes P.J., Smyth M.R., McMurrough I.: Analyst 112, 1205 (1987).
7. Fleet B., Little C.J.: J. Chromatogr. Sci. 12, 747 (1974).
8. Madigen D., McMurrough I., Smyth M.R.: Analyst 119, 863 (1994).
9. Peyrat-Maillard M.N., Bonnely S., Berset C.: Talanta 51, 709 (2000).
10. ESA: The Working Electrode – díl 1; The Reference Electrode – díl 2. ESA Inc., Chelmsford 1998.
11. Achilli G., Cellerino G.P., Gamache P.: J. Chromatogr. 632, 111 (1993).
12. Gamache P., Ryan E., Acworth I.N.: J. Chromatogr. 635, 143 (1993).