Characterization of control and stress induced samples of trastuzumab biosimilar using LCMS-9030 by bottom-up approach

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují významnou třídu bioterapeutik využívaných v léčbě onemocnění od rakoviny až po zánětlivá onemocnění. Během výroby, skladování i aplikace jsou však vystaveny stresu, který může vést ke vzniku nežádoucích posttranslačních modifikací, především oxidaci a deamidaci. Včasné a přesné určení těchto modifikací je klíčové pro zajištění kvality, stability a účinnosti konečného přípravku.

Cíle a přehled studie / článku

Účelem studie bylo aplikovat bottom-up peptide mapping přístup na kontrolní a uměle stresované vzorky trastuzumabu biosimilaru za účelem detailní charakterizace míst náchylných k oxidaci a deamidaci. Použitá strategie umožnila porovnat relativní abundanci modifikovaných peptidů v jednotlivých podmínkách.

Použitá metodika

Pro indukci deamidace byla vzorku mAb při pH 9 inkubována 7 dnů při 37 °C. Oxidace byla vyvolána přidáním 30 % H₂O₂ a inkubací 1 h při 37 °C, reakce byla zneutralizována metioninem. Vzorky následně podléhaly redukci (DTT, 8 M močovina), alkylaci (iodacetamid), tryptickému štěpení (enzym:mAb 1:50, přes noc) a SPE čistění. Eluát byl rekonstituován ve vodě/formamid:acetonitril a analyzován v režimu Data Dependent Acquisition (DDA).

Použitá instrumentace

• HPLC systém: Shimadzu Nexera X2 s kolonkou Shim-pack Arata Peptide C18 (100 mm × 2,0 mm, 2,2 µm), teplota 40 °C, gradient 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě vs. acetonitril.
• MS: LCMS-9030 Q-TOF s Heated ESI v pozitivním módu, TOF survey scan 200–2500 m/z, DDA MS/MS 100–2800 m/z, collision energy spread 18–52 V.
• Software: LabSolutions LCMS pro sběr dat, Protein Metrics pro identifikaci peptidů a PTM (přesnost prekurzorů 6 ppm, fragmenty 20 ppm, fixní karbamidomethylace, variabilní PTM včetně oxidační a deamidace a N-glykosylace z databáze).

Hlavní výsledky a diskuse

Peptidové mapování přineslo více než 92 % pokrytí primární struktury obou řetězců s hmotnostnou přesností pod 2 ppm pro peptidy o délce 4–63 aminokyselin. Využití collision energy spread zajistilo bohaté fragmentační spektrum a umožnilo jednoznačné přiřazení pozic oxidace (např. peptid DTLMISR) a deamidace (ASQDVNTAVAWYQQKPGK). Analýza relativní abundancí odhalila klíčová místa náchylná k oxidaci (HC-361, HC-107, HC-431) a deamidaci (LC-30, HC-318, HC-55, HC-84). Vzorky pod oxidativním stresem vykázaly výrazně vyšší míru oxidačních modifikací než kontroly či vzorky s indukovanou deamidací.

Přínosy a praktické využití metody

Tato workflow podporuje detailní charakterizaci kritických kvalitativních atributů (CQA) mAb, umožňuje identifikovat slabá místa náchylná k degradaci a poskytuje základ pro rozvoj komplexních Multiple-Attribute Methods (MAM) v QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metodiky o víceenzymatické štěpení pro zvýšení sekvenčního pokrytí, vylepšenou interní kalibraci pro dlouhodobou stabilitu hmotnostní přesnosti a větší míru automatizace analýzy. Dále se předpokládá integrace glykomické analýzy a pokročilých AI nástrojů pro rychlejší interpretaci PTM dat.

Závěr

Popsaný bottom-up přístup na platformě LCMS-9030 pro analýzu trastuzumabu biosimilaru prokázal vysokou citlivost, spolehlivost a schopnost detailně mapovat PTM. Workflow usnadní průmyslovou implementaci MAM a přispěje ke zvýšení kvality a stability terapeutických mAb.

Reference

1. Physicochemical Stability of Monoclonal Antibodies: A Review, Journal of Pharmaceutical Sciences, Volume 190, 169–190, 2020
2. Rapid assessment of oxidation via middle-down LCMS correlates with methionine side-chain solvent-accessible surface area for 121 clinical stage monoclonal antibodies, Mabs, 9(4), 646–653, 2017
3. Data-Dependent Analysis Approach in LC/HRMS: Annotation of Natural Product Components, 04-JMST-208-EN
4. Monoclonal Antibody Workflows on the Shimadzu Q-TOF LCMS-9030 Using the Protein Metrics Software Suite, SSI-LCMS-103
5. Structural Elucidation of Post-Translational Modifications in Monoclonal Antibodies, ACS Symposium Series, 1201, 119–183, 2015