Fast Profiling of 39 Bile Acids in Plasma, Urine and Feces, by Automated Extraction and LCMS-8060NX

Význam tématu

Profilování žlučových kyselin (ŽK) v biologických vzorcích má zásadní význam pro pochopení trávení tuků a regulaci metabolismu cholesterolu. Celková koncentrace ŽK v krevní plazmě slouží jako citlivý biomarker jaterní dysfunkce a jejich podrobná analýza umožňuje odlišit různé typy jaterních onemocnění.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout a ověřit rychlou a reprodukovatelnou metodu pro kvantifikaci 39 ŽK ve vzorcích plazmy, moči a stolice s využitím automatizované extrakce a rychlého LC–MS/MS.

Použitá metodika a instrumentace

Automatizovaná příprava vzorků proběhla na systému Biotage Extrahera, kde bylo v 96-jamkové destičce extrahováno až 96 vzorků během 45 minut. Pro stolici byla přidána hydrolytická fáze (KOH, 80 °C, 20 minut). Analýza probíhala na UHPLC Nexera X2 spojeném s trojitým kvadrupólem LCMS-8060NX. Separace využila kolonu ACE Excel C18 Amide při 45 °C s mobilními fázemi vodného roztoku s kyselinou mravenčí a směsi acetonitrilu/methanolu.

Hlavní výsledky a diskuse

• Rozlišení a senzitivita: Metoda dosahuje plného rozlišení isomerů ŽK s dobou analýzy 10 minut.
• Reprodukovatelnost: RSD retencí pod 0,5 % a RSD ploch pod 20 %.
• Kvantifikace: Vyhodnoceno standardem přídavku, interní kalibrací (1-bodová) a přímou izotopovou dilucí. Všechny přístupy prokázaly přesnosti 80–120 % ve všech maticích.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká propustnost: až 96 vzorků za hodinu.
• Snížení pracovních nákladů díky automatizaci přípravy.
• Komplexní profil 39 ŽK umožňuje sofistikovanou diagnostiku jaterních a střevních onemocnění.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze dále rozšířit o další metabolity žluči, integrovat do klinických a toxikologických studií nebo využít pro screening interakcí se střevní mikrobiotou. Vývoj rychlejších HPLC fází a pokročilých datových analýz (strojové učení) podpoří ještě větší propustnost a automatizaci výsledků.

Závěr

Popsaná LC–MS/MS metoda s automatizovanou extrakcí splňuje požadavky na vysokou citlivost, reprodukovatelnost a propustnost pro komplexní analýzu žlučových kyselin ve třech klíčových biologických matricích. Představuje plnohodnotné řešení pro rutinní laboratorní provoz.

Použitá instrumentace

• Automatizovaný extrakční systém Biotage Extrahera™
• UHPLC Nexera™ X2
• Hmotnostní spektrometr LCMS-8060NX™ s ESI (negativní ionizace)
• Kolona ACE Excel C18 Amide (ADVANCED CHROMATOGRAPHY TECHNOLOGIES)

Reference

1. Shimadzu, LC/MS/MS Method Package for Bile Acids ver. 2, P/N S225-38610-91.
2. Advanced Chromatography Technologies, ACE Excel C18 Amide, P/N EXL-1712-7502U.