Sensitive Simultaneous Analysis of Lactose, Allolactose, Lactulose and Saccharides Contained in Low Lactose Dairy Products Using HPLC with Post-column Fluorescence Derivatization Method

Význam tématu

Analýza stopových množství laktózy a příbuzných sacharidů v nízkolaktózových mléčných výrobcích je klíčová pro zajištění declarační pravdivosti označení „nízkolaktózové“ či „bez laktózy“, zejména pro osoby s intolerancí. Vzhledem k přísným limitům v některých regionech (0,01–1 g/100 g) a absenci jednotných kritérií v jiných oblastech je potřeba citlivých a spolehlivých metod, které dokážou rozlišit laktózu od strukturně podobných látek jako allolaktóza či laktulóza a kvantifikovat je v komplexním maticovém vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit vysoce citlivou metodiku současné separace a kvantifikace devíti sacharidů (xyloza, arabinoza, fruktóza, manóza, glukóza, galaktóza, laktulóza, laktóza, allolaktóza) v nízkolaktózovém mléce. Saccharidy byly extrahovány 70% acetonitrilovou vodou, separovány HILIC kolonou a detekovány po postkolonové derivatizaci fluorescenčním detektorem.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byl použit HILIC systém NexeraTM se stacionární fází NH2P-50 a NH2P-50G guard kolona. Pohyblivé fáze tvořila směs acetonitrilu a vody s přídavkem kyseliny fosforečné, gradient byl optimalizován pro dokonalou separaci všech devíti sacharidů. Postkolonová reakce probíhala v prostředí boritan-arginin při 150 °C, reakční kolo z nerezové oceli umožňovalo stabilní tvorbu fluorescenčních derivátů.

Použitá instrumentace

• HPLC systém: Shimadzu NexeraTM Reducing Sugar Analysis System
• Kolona: Shodex Asahipak NH2P-50 (250×4,6 mm, 5 μm) a guard kolona NH2P-50G (10×4,6 mm, 5 μm)
• Postkolonová derivatizace: arginin/boritan/potasy hydroxid
• Fluorescenční detektor: RF-20Axs (Ex 320 nm, Em 430 nm)
• Reakční cívka: SUS tubing, 8 m × 0,5 mm I.D.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla vynikajících separačních parametrů – devět sacharidů bylo plně rozlišených. Kalibrační křivky vykázaly linearitu s r2 > 0,9999 v definovaném rozsahu koncentrací. Limity stanovitelnosti (LOQ) se pohybují v řádu jednotek mg/L, což umožňuje detekovat zbytky laktózy a příbuzných sloučenin pod regulačními prahem. Analýza nízkolaktózového mléka prokázala přítomnost glukózy, galaktózy, laktulózy, laktózy a allolaktózy, přičemž průměrné procento rekonstrukce standardu dosahovalo >95 % ve vzorcích n=3, což potvrzuje spolehlivost metody ve skutečných maticích.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoce citlivé a selektivní stanovení laktózy a analogů v nízkolaktózových výrobcích
• Možnost kontroly kvality a souladu s legislativními požadavky
• Vhodné pro rozbory ve výrobních a výzkumných laboratořích, QA/QC v mlékárenském průmyslu

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj metodiky lze směřovat k automatizaci přípravy vzorků, zkrácení doby analýzy pomocí rychlejších gradientů či kapalinových chromatografií UPLC, příp. kombinaci s hmotnostní detekcí pro ještě vyšší selektivitu. Dále se očekává rozšíření aplikací na další potravinářské matice a validace podle mezinárodních norem.

Závěr

Popsaná metoda HILIC-LC s postkolonovou fluorescenční derivatizací nabízí robustní, vysoce citlivou a reprodukovatelnou analýzu laktózy, allolaktózy, laktulózy a dalších sacharidů v nízkolaktózových mléčných výrobcích. Výborné separační i kvantifikační vlastnosti umožňují její nasazení v rutinní praxi i vědeckém výzkumu.