Fast and sensitive determination of lactose in lactose-free products using HPAE-PAD

Význam tématu

Stanovení stopového množství laktózy v produktech označených jako „bez laktózy“ je klíčové pro zajištění bezpečného užívání potravin osobami s laktózovou intolerancí a pro splnění legislativních požadavků na označování. I enzymatická hydrolýza zanechává v produktech reziduální laktózu, jejíž koncentrace se může pohybovat pod stávajícími prahy pro termíny „laktózová volná“ či „velmi nízký obsah laktózy“.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout rychlou, citlivou a reprodukovatelnou metodu založenou na vysokovýkonné aniontově výměnné chromatografii s pulzní amperometrií (HPAE-PAD) pro simultánní stanovení disacharidů všecholaktózy, laktózy, laktulózy a epilaktózy v širokém spektru komerčních „bezlaktózových“ mléčných výrobků a potravin z pečiva.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci a detekci sacharidů byla využita technika HPAE-PAD, která nevyžaduje derivatizaci vzorku a umožňuje přímé stanovení sacharidů s vysokou citlivostí.

• Chromatografický systém: Thermo Scientific Dionex ICS-5000+ HPIC
• Kolona: Dionex CarboPac PA210 4 × 150 mm, 4 µm, s prekolonou CarboPac PA210 4 × 30 mm
• Detekce: pulzní amperometrie na jednorázové Au elektrodě, waveform TN21
• Eluent: KOH gradient (0–10 min 23 mM, 10–15 min 100 mM, 15–30 min 23 mM), generátor eluentu EGC 500
• Podmínky: teplota kolony 30 °C, rychlost 0,8 mL/min, objem injekce 10 µL
• Příprava vzorků: srážení proteinů Carrez I/II, čištění OnGuard IIA, filtrace 0,2 µm

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizací na isokratické rozložení 23 mM KOH byla dosažena baseline separace laktózy, všecholaktózy, laktulózy a epilaktózy do 9 minut a celkový cyklus 30 min.
Kalibrační křivky pro analyty 0,25–20 mg/L vykázaly koeficient determinace r2 > 0,999; limity detekce LOD byly mezi 0,009 a 0,017 mg/L, LOQ mezi 0,029 a 0,056 mg/L.
V 11 testovaných „bezlaktózových“ produktech (mléčné nápoje, jogurt, sýr, máslo, sušenky, čokoláda) byly zjištěny reziduální hladiny laktózy a všecholaktózy v rozmezí 0,001–0,114 g/100 g. U většiny vzorků (kromě dvou mléčných výrobků) se obsah laktózy pohyboval pod 0,01 g/100 g s přesností stanovení 87–107 % a recovery 80–110 %. Laktulóza nebyla v žádném vzorku detekována.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlé, citlivé a přesné sledování nízkých reziduálních koncentrací laktózy i blízce příbuzných sacharidů ve výrobcích označených jako „bezlaktózové“. Díky eliminaci derivatizace má vysokou reprodukovatelnost, nízké pozadí a vhodnost pro rutinní QA/QC i legislativní kontrolu označování potravin.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zkracování analýz při zachování rozlišovací schopnosti, širší automatizace procesů přípravy vzorku a integrace metod do systémů LIMS. Rozvoj colon s menším průměrem a rychlejšími gradien–ními profily umožní ještě vyšší propustnost laboratoří. Možné je rozšíření aplikace na prebiotické oligosacharidy a další deriváty získané transgalaktosylací.

Závěr

Vyvinutá HPAE-PAD metoda na bázi CarboPac PA210-4 µm kolony prokázala vysokou citlivost, linearitu a opakovatelnost pro stanovení laktózy a příbuzných sacharidů v potravinách „bez laktózy“. Hodí se pro rutinní analýzy s cílem zajištění kvality, označování a ochrany spotřebitelů s intolerancí laktózy.

Reference

1. Commission Directive 2006/141/EC of 22 December 2006, Official Journal of the European Union, L 401, 2006.
2. EFSA NDA Panel. Scientific opinion on lactose thresholds in lactose intolerance and galactosaemia. EFSA Journal 2010;8(9):1777.
3. U.S. Department of Health and Human Services FDA. Grade “A” Pasteurized Milk Ordinance, 2009 Revision.
4. Langer AJ et al. Nonpasteurized dairy products, disease outbreaks and state laws—United States, 1993–2006. Emerg Infect Dis 2012;18(3):385–391.
5. Seki N, Saito H. Lactose as a source for lactulose and other functional lactose derivatives. Int Dairy J 2012;22:110–115.
6. Fransen CTM et al. α-D-Glcp-(1↔1)-β-D-Galp-containing oligosaccharides: novel products from lactose by β-galactosidase. Carbohydr Res 1998;314:101–114.
7. Adachi S. Formation of lactulose and tagatose from lactose in strongly heated milk. Nature 1958;181:840–841.
8. Kuschel B et al. Analyse von Präbiotika in Milch: Laktose, Lactulose und Epilactose. Biospektrum 2017;23:833.
9. van Riel J, Olieman C. Selectivity control in the anion-exchange chromatographic determination of saccharides in dairy products using pulsed amperometric detection. Carbohydr Res 1991;215(1):39–46.
10. Monti L et al. Lactose, galactose and glucose determination in naturally lactose free hard cheese: HPAEC-PAD method validation. Food Chem 2017;220:18–24.
11. Thermo Fisher Scientific. AN248: Determination of lactose in lactose-free milk products by HPAEC-PAD. 2017.
12. van Scheppingen WB et al. Selective and sensitive determination of lactose in low-lactose dairy products with HPAEC-PAD. J Chromatogr B 2017;1060:395–399.
13. Thermo Fisher Scientific. TN71: Eluent Preparation for HPAE-PAD. 2017.
14. Thermo Fisher Scientific. AN1158: HPAE-PAD Determination of Carbohydrates in Honey. 2017.