Next-generation MALDI top-down sequencing of protein biotherapeutics – expanding the scope of timsTOF technology

Význam tématu

Top-down sekvenování proteinů umožňuje přímé mapování primární struktury a modifikací souvisejících s kvalitou bioterapeutik. MALDI-TDS v kombinaci s TIMS rozšiřuje schopnosti analýzy přidáním další separační dimenze, což přináší vyšší spolehlivost při detekci neočekávaných variant a neznámých sekvencí.

Cíle a přehled studie / článku

Tento článek popisuje next-generation MALDI top-down sekvenování (MALDI-TDS) na platformě Bruker timsTOF fleX za účelem komplexní analýzy bílkovin v biopharma výzkumu. Demonstrace proběhla na bovinní karbonické anhydráze II, subjednotkách adalimumabu a rekombinantním SARS-CoV-2 receptor binding doméně (RBD).

Použitá metodika a instrumentace

Spectrometrická platforma Bruker timsTOF fleX s duálním ESI/MALDI zdrojem, ultrarychlý TOF analyzátor (rozlišení 60 000, hm. přesnost <2 ppm) a Trapped Ion Mobility Spectrometry (TIMS) jako dodatečná separační dimenze. Laser smartbeam 3D, m/z rozsah 1 000–15 000. Software: timsControl 2.0, DataAnalysis 5.3, BioPharma Compass 2021b, BioTools 3.2. Příprava vzorků zahrnovala rozpuštění v 0,1 % TFA, deglykosylaci enzymy PNGase F a SialEXO, redukci disulfidů DTT nebo TCEP, aplikaci matrice SDHB na MALDI destičky a kalibraci širokého m/z rozsahu červeným fosforem.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza bovinní CA II přinesla simultánní záznam intact mass a N- i C-terminálních ISD fragmentů s vysokým rozlišením a sekvenační validací 86,9 %. TIMS umožnil rozlišení isobarických fragmentů a zvýšil čistotu MS/MS pro T3-Sequencing. Subjednotky adalimumabu vykázaly sekvenační validaci 68–83 %, potvrzení C-terminální ztráty lysinu a pyroglutamylace N-terminu. U SARS-CoV-2 RBD byla identifikována O-glykosylace na Thr-6 ve formách core 1 i core 2 na základě intact mass posunů a interference-free T3 spektrem.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá top-down analýza bez nutnosti LC kroku
• Simultánní získání intact mass a terminálních sékvencí v jednom měření
• Vysoké rozlišení a přesnost (<2 ppm) pro jednoznačnou identifikaci
• Dodatečná separační dimenze TIMS pro snížení komplexity spekter
• Univerzální platforma pro ESI i MALDI v jediné instrumentaci

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace workflow v QA/QC biotechnologií
• Integrace s dalšími separačními metodami pro komplexní analýzu glykoform
• Vývoj nových matric a chemických modifikátorů pro cílené sekvenování
• Využití TIMS pro multidimenzionální proteomické studie
• Zvýšení throughput pro vysokokapacitní laboratorní provozy

Závěr

Next-generation MALDI-TDS na platformě timsTOF fleX představuje výkonnou top-down metodu s vysokou citlivostí, rozlišením a přesností pro charakterizaci bioterapeutických proteinů. Přidání TIMS dimenze zvyšuje kvalitu dat a usnadňuje interpretaci, čímž zajišťuje spolehlivou detekci neočekávaných modifikací a variant.

Reference

1. Srzentić K et al., J Am Soc Mass Spectrom 2020;31(9):1783-1802
2. Gstöttner C et al., Anal Chem 2021;93(17):6839-6847
3. Gstöttner C et al., Bruker Application Note MT-132
4. Yoo C et al., J Am Soc Mass Spectrom 2009;20(2):326-333
5. Ayoub D et al., MAbs 2013;5(5):699-710
6. Resemann A et al., MAbs 2016;8(2):318-330
7. Welsink T, InVivo Application Note 1885914
8. Suckau D & Resemann A, Anal Chem 2003;75(21):5817-5824