Investigating the increased lifespan in C. elegans daf-2 mutants by 4D-Lipidomics

Význam tématu

Analýza lipidů hraje klíčovou roli v pochopení biologických procesů spojených se stárnutím a metabolickou regulací. Caenorhabditis elegans je v laboratorním výzkumu oblíbený modelový organismus díky své genetické manipulovatelnosti a krátké generaci. Mutace daf-2, ovlivňující receptor podobný IGF-1, dramaticky prodlužuje životnost červů a mění jejich lipidom. Systémová 4D-Lipidomika, zahrnující chromatografii, vysokorozlišenou hmotnostní spektrometrii, iontovou mobilitu a MS/MS, umožňuje komplexní mapování lipidových změn.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout a demonstrovat integrovaný pracovní postup 4D-Lipidomika se softwarem MetaboScape®, který přináší:

• Vysokou pokrytí lipidového profilu C. elegans (divoký typ vs. daf-2).
• Rychlé a spolehlivé přiřazení lipidů kombinací PASEF MS/MS a CCS dat.
• Statistickou analýzu k detekci klíčových rozdílů mezi skupinami.

Použitá instrumentace

Pro analýzu lipidových extraktů byl použit systém UHPLC spojený s Bruker timsTOF Pro.

• Ionizační zdroj: Apollo II ESI (pozitivní režim 4500 V, negativní 4200 V).
• Kolona: Bruker intensity C18 (100×2,1 mm, 1,9 µm), teplota 55 °C.
• Mobilní fáze: A (ACN/H2O 60:40, 10 mM NH4-formiát, 0,1 % FA), B (IPA/ACN 90:10, 10 mM NH4-formiát, 0,1 % FA).
• Metoda: PASEF (100–1500 m/z), paralelní akumulace se sériovou fragmentací.
• Software: MetaboScape® 5.0 s modu­ly T-ReX 4D a CCSPredict.

Použitá metodika

Synchronizované populace C. elegans (divoký typ a daf-2(e1370)) byly pěstovány na NGM, následně extrahovány organickou fází MTBE. Lipidy se rekonstituovaly v ACN/IPA/voda (65/30/5). Vzorky byly analyzovány jako tři biologické a tři technické replikáty v pozitivním i negativním režimu. Data byla zpracována T-ReX 4D: chromatografická a mobilitní kalibrace, detekce bucketů, přiřazení izotopů, aduktů a MS/MS spekter. CCS hodnoty byly extrahovány a porovnány s predikcemi CCSPredict a databází CCS Compendium.

Hlavní výsledky a diskuse

• V merged sadě pozitivních a negativních dat bylo identifikováno 1358 lipidů.
• PCA prokázala jasné oddělení divokého typu a daf-2 mutantů; jedním z klíčových lipidů byl PC 40:10 obsahující dvě C20:5 mastné kyseliny.
• MS/MS PASEF spektra poskytla charakteristické fragmenty hlaviček i vedlejších ztrát, potvrzující skladbu lipidů.
• CCS hodnoty byly vysoce reprodukovatelné (průměrná odchylka 0,23 %) a shodné s databázovými hodnotami (průměrná odchylka <1 %).

Přínosy a praktické využití metody

Integrovaný 4D-Lipidomika workflow umožňuje rychlou a spolehlivou charakterizaci složitého lipidomu i v malých biologických vzorcích. Vysoká průchodnost PASEF v kombinaci s iontovou mobilitou a CCS poskytuje bezkonkurenční kvalitu dat, vhodných pro výzkum stárnutí, metabolických poruch a farmakologických zásahů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření CCS databází a zdokonalování strojového učení pro predikci strukturově specifických CCS hodnot.
• Automatizace a standardizace 4D-Lipidomiky pro klinické a průmyslové aplikace.
• Integrace lipidomických dat s proteomikou a metabolomikou pro system biology přístupy.

Závěr

Pracovní postup 4D-Lipidomika kombinovaný s MetaboScape® a timsTOF Pro poskytuje robustní platformu pro detailní analýzu lipidů v modelu C. elegans. Vysoká citlivost, šíře pokrytí a důvěryhodnost přiřazení lipidů otevírají nové možnosti ve studiu stárnutí, metabolických změn a dalších biomedicínských tématech.

Reference

[1] Castro C et al. Mol BioSyst 2013;9:1632–1642
[2] Witting M, Schmitt-Kopplin P. Arch Biochem Biophys 2016;589:27–37
[3] Witting M et al. J Chromatogr A 2014;1359:91–99
[4] Hänel V et al. Chem Phys Lipids 2019;222:15–22
[5] Meier F et al. J Proteome Res 2015;14:5378–5387
[6] Bruker LCMS-158 (2019)
[7] Matyash V et al. J Lipid Res 2008;49(5):1137–1146
[8] Fiehn Lab LipidBlast project
[9] Kind T et al. Nature Methods 2013;10:755–758
[10] Kind T et al. Anal Chem 2014;86(22):11024–11027
[11] Ma Y et al. J Cheminformatics 2015;7:53
[12] Tsugawa H et al. Nature Methods 2015;12:523–526
[13] Zhou Z et al. Anal Chem 2017;89(17):9559–9566
[14] Picache JA et al. Chem Sci 2019;10:983