4D-Lipidomics™ workflow for increased throughput

Význam tématu

Profilování lipidů v komplexních extraktech je klíčové pro biochemii, klinický výzkum i průmyslovou kontrolu kvality. Vysoká strukturální různorodost, výskyt isobarických a izomerických forem a široký dynamický rozsah koncentrací představují významné analytické výzvy. Využití čtyřrozměrných dat (m/z, retence, iontová mobilita, intenzita) společně s moderní hmotnostní spektrometrií zvyšuje selektivitu, spolehlivost identifikace a propustnost analýzy lipidů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo představit integrovaný 4D-Lipidomics workflow, který kombinuje ultrarychlou chromatografii, PASEF akvizici s měřením CCS hodnot a pokročilé softwarové nástroje pro pravidlovou anotaci. Workflow bylo demonstrováno na referenční plazmě SRM 1950 a hodnoceny byly parametry jako fragmentační pokrytí, počet identifikovaných lipidů a reprodukovatelnost při různých délkách LC gradientů.

Použitá metodika

Lipidové extrakty z plazmy SRM 1950 byly připraveny metodou založenou na MTBE. Extrakty se rozpouštěly v methanol:dichlormethan (9:1) a injikovaly do RP-UHPLC s gradienty délky 20, 10 a 5 minut. Čtyřrozměrná data byla získána režimem PASEF na instrumentech timsTOF Pro a timsTOF fleX. Zpracování zahrnovalo algoritmus T-ReX 4D, CCSPredict pro předpověď CCS, pravidlovou anotaci a knihovnu LipidBlast v softwaru MetaboScape 2021b. Validace anotací využívala 4D Kendrickovy masové defektové ploty.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Elute (Bruker) s kolonkou YMC Triart C18 (100×2,1 mm, 1,9 µm)
• timsTOF Pro a timsTOF fleX (Bruker Daltonik)
• ESI zdroj Apollo II
• Akviziční režim PASEF (100 ms ramp time, 2 rampy/cyklus)
• Software MetaboScape 2021b s moduly T-ReX 4D, CCSPredict, rule-based annotation a knihovna LipidBlast

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow dosahuje MS/MS pokrytí více než 65 % fragmentovaných prekurzorů při jediné injekci. S 20min gradientem bylo identifikováno 362 unikátních lipidů, přičemž i v nejrychlejším 5min gradientu zůstalo 271 (~75 %) druhů. CCS hodnoty vykazují vynikající korelaci mezi různými délkami gradientů (R2 > 0,998) a nezávisí na chromatografických podmínkách, což z nich činí spolehlivý kvalifikátor. 4D Kendrickovy defektové ploty usnadňují odhalení potenciálních falešných anotací a chybějících lipidů. Prostorová distribuce lipidových tříd v m/z vs. CCS prostoru potvrdila konzistentní trendy a robustnost metody. Integrace s MALDI Imaging pomocí SpatialOMx workflow umožnila mapování identifikovaných lipidů v tkáňových vzorcích.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza s vysokým pokrytím lipidových tříd vhodná pro fenomiku a rozsáhlé kohortové studie
• CCS-aware anotace zvyšuje důvěryhodnost identifikací lipidů
• Automatizované pracovní postupy v MetaboScape zkracují dobu zpracování velkých datových souborů
• Možnost propojení s prostorovým zobrazováním v MALDI Imaging

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zkrácení doby analýzy při zachování detailního pokrytí lipidů, rozšíření CCS knihoven a aplikace strojového učení pro rychlejší a přesnější anotaci. Kombinace 4D-Lipidomics s dalšími omickými přístupy a in vivo zobrazováním nabídne komplexnější pohled na metabolické cesty a patologické mechanismy v klinických a biologických studiích.

Závěr

Prezentovaný 4D-Lipidomics workflow spojuje rychlou chromatografii, PASEF akvizici a CCS-aware softwarovou anotaci pro efektivní a spolehlivou analýzu komplexních lipidových extraktů. Studie prokázala vysokou reprodukovatelnost, široké pokrytí lipidových tříd a vhodnost pro vysokoprodukční aplikace.

Reference

• Züllig et al. Mass Spectrom. Rev. 2020; DOI:10.1002/mas.21627
• Mann et al. Mol. Cell Proteomics. 2018;17(12):2534–2545. DOI:10.1074/mcp.TIR118.000900
• Matyash et al. J. Lipid Res. 2008;49:1137–1146
• Liebisch et al. J. Lipid Res. 2020;61:1539–1555
• Tsugawa et al. Nat. Biotechnol. 2020;38:1159–1163
• Hayen et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2018;32:981–991
• Hayen et al. Anal. Chem. 2021;93(4):2135–2143
• Helmer et al. Anal. Chem. 2021