In Depth Analysis of Host Cell Proteins from Antibody Preparations using PASEF

Význam tématu

Analýza hostitelských proteinů (HCP) v přípravcích monoklonálních protilátek je klíčová pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti bioterapeutik. Tradiční ELISA metodika poskytuje cílové kvantifikace, ale nedokáže komplexně pokrýt všechny HCP v nízkých ppm hladinách. Moderní přístupy založené na hmotnostní spektrometrii (MS) nabízejí necílovou identifikaci drobných stopových nečistot a rozšiřují možnosti monitoringu výrobních procesů.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo ověřit využití PASEF (parallel accumulation–serial fragmentation) skenů na přístroji timsTOF Pro pro citlivou a rychlou detekci HCP v přípravcích NISTmAb. Studie porovnala analytické a nanoflow UHPLC konfigurace, stanovila limit detekce na úrovni jednotek ppm a ukázala schopnost PASEF dosáhnout hloubkové pokrytí HCP profilu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky:

• Referenční materiál NISTmAb (25–30 µg na injekci).
• UPS1 standard pro stanovení lineárních rozsahů (diluce 0,3–934 ppm v konstantní matrici NISTmAb).

Štěpení proteinů:

• Redukce pomocí DTT v TFE.
• Alkylace jodacetamidem.
• Přes noc digesce trypsinem.

Chromatografie a MS:

• Elute UHPLC s analytickým Intensity Solo2 1,8 µm C18 kolonnem (100×2,1 mm, gradient 150 min).
• nanoElute UHPLC s IonOpticks 1,6 µm C18 kolonnem (25 cm×75 µm, gradient 210 min).
• timsTOF Pro QTOF s PASEF scan mode.
• Data zpracována v PEAKS Studio a Mascot (1 % FDR, Ion Score > 20).

Hlavní výsledky a diskuse

1. Citlivost a linearita:

• PASEF umožnil kvantifikaci UPS1 proteinů, např. β2-mikroglobulin a NAD(P)H dehydrogenáza, v jednotkách ppm s lineárním rozsahem přes 0,3–934 ppm.

2. Identifikace HCP v NISTmAb analyticky:

• Detekováno 18 HCP s ≥ 3 peptidy a 10 s 2 peptidy při 1 % FDR.
• Příklady: Fructóza-bisfosfát aldoláza A, Glukóza-6-fosfát izomeráza, protein-disulfid izomeráza.

3. Nanoflow režim pro hlubší pokrytí:

• Při injekci 1,5 µg NISTmAb identifikováno přes 200 HCP, z toho 78 s ≥ 2 peptidy.
• Nové, dosud nepopsané HCP pro NISTmAb rozšířily znalost profilu nečistot.

4. Technologický základ PASEF:

• TIMS separuje ionty na základě kolizního průřezu, zvyšuje selektivitu a intenzitu fragmentace.
• PASEF dosahuje skenovací frekvence > 100 Hz s vysokou kvalitou MS/MS spekter.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá necílová detekce HCP bez nutnosti specifických ELISA sad.
• Citlivost na úrovni jednotek ppm vhodná pro QC a vývoj procesů (QA/QC, procesní kontrola).
• Schopnost fingerprintingu výrobních šarží a prokazování vlivu změn procesů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dálší integrace TIMS-PASEF do standardních QC workflow pro automatizaci a monitoring v reálném čase.
• Rozšíření databází HCP pro přesnější identifikaci a kvantifikaci v různých bioproduktech.
• Vývoj rychlých metod zkracujících chromatografické běhy bez ztráty citlivosti.
• Využití pokročilých algoritmů strojového učení pro interpretaci komplexních MS dat.

Závěr

Studie prokázala, že PASEF na timsTOF Pro umožňuje spolehlivou a citlivou analýzu HCP v antibody preparátech na úrovni jednotek ppm. Díky kombinaci TIMS separace a vysoké rychlosti fragmentace se rozšířil záběr detekovatelných nečistot a zvýšila se efektivita rutinních i výzkumných aplikací v bioprocesním vývoji.

Reference

1. Meier M. et al. J Proteome Res. 2015 Dec;14(12):5378–5387.
2. Lubeck M. et al. Bruker Application Note LCMS 131, PASEF™ on timsTOF Pro, 09/2017.