High-speed MALDI-TOF/TOF imaging of mouse brain tissue performed on intact proteins and after on-tissue digestion

Význam tématu

MALDI-MSI představuje klíčovou metodu pro prostorové mapování biomolekul ve tkáních. Systémy MALDI-TOF/TOF nabízejí unikátní možnost sledovat intactní proteiny i tryptické peptidy z on-tissue digesce, čímž umožňují detailní analýzu proteoform a specifických peptidů s vysokým hmotnostním rozlišením a přesností.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat schopnosti přístroje RapifleX MALDI-TOF/TOF při zobrazování intactních proteinů i tryptických peptidů v čerstvě zmrazených řezích myšího mozku a porovnat top-down a bottom-up workflow včetně on-tissue MS/MS identifikace peptidů.

Použitá instrumentace

• Bruker RapifleX MALDI-TOF/TOF
• HTX TM-sprayer (HTX Technologies)
• Reflecta MF-5000 slide scanner
• SCiLS Lab software pro analýzu dat

Použitá metodika

Vzorky: 10 µm čerstvé zmrazené sagitální řezy myšího mozku na polylysinem potažených vodivých slajdech. Carnoy protokol pro odmaštění a odsolení. On-tissue digesce: nanášení trypsinu (25 ng/µl) HTX TM-sprayerem, inkubace 2 h při 50 °C. Matrix: sinapinová kyselina pro intactní proteiny, HCCA pro peptidy, nanášeno HTX TM-sprayerem. Akvizice: pixel size 30 µm; intactní proteiny v linear módu (m/z 2000–24000) s 600 laserovými zásahy; peptidy v reflector módu (m/z 600–2400) s 400 zásahy; on-tissue MS/MS fragmentace vybraných prekurzorů bez kolizního plynu.

Hlavní výsledky a diskuse

• Segmentace intactních proteinů odlišila cortex a cerebellum na základě distribuce histonových proteoform (H1, H2A/B, H3, H4).
• ROC analýza potvrdila m/z signály odpovídající specifickým histonům s vyšší expresí v cerebellu.
• Bottom-up imaging peptidů umožnilo detekci a mapování větších proteinů a verifikaci identit peptidů (např. ARTKQTAR z histonu 3.3) pomocí MS/MS.
• RapifleX dosahuje dvojnásobného prostorového rozlišení a až 14× vyšší rychlosti akvizice oproti předchozím konfiguracím.

Přínosy a praktické využití metody

• Kombinace top-down a bottom-up přístupů umožňuje komplexní charakterizaci proteoform a peptidů ve stejném vzorku.
• Vysoké rozlišení a přesnost podporují studium epigenetických modifikací a biomarkerů v klinických i preklinických výzkumech.
• Možnost rychlého a detailního prostorového mapování molekul v biomedicínských i farmaceutických aplikacích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zvyšování prostorového rozlišení a rychlosti akvizice laserem.
• Integrace s multimodálními zobrazovacími metodami (MRI, fluorescenční mikroskopie).
• Automatizace a vysoká propustnost workflow pro klinické a farmaceutické aplikace.
• Využití strojového učení pro pokročilou analýzu prostorových proteomických dat.

Závěr

RapifleX MALDI-TOF/TOF ve spojení s on-tissue digescí a MS/MS představuje všestrannou platformu pro vysokorychlostní a vysoce kvalitní MALDI-MSI intactních proteinů i peptidů. Kombinace top-down a bottom-up přístupů zajišťuje detailní prostorovou charakterizaci proteoform a jejich identit.

Reference

1. Rauser S., Marquardt C., Balluff B. a kol. J. Proteome Res. 2010, 9(4), 1854–1863.
2. Lahiri S., Sun N., Solis-Mezarino V. a kol. Proteomics 2016, 16, 437–447.
3. Alexandrov T., Becker M., Deininger S.-O. a kol. J. Proteome Res. 2010, 9(12), 6535–6546.