Ion Mobility Mass Spectrometry of Glyco-and Phospho-Peptides

Význam tématu

Analýza glykosidických a fosforylovaných peptidů je klíčová pro pochopení buněčných procesů a identifikaci biomarkerů. Ion mobility mass spectrometry (TIMS-TOF) přináší další dimenzi separace, která umožňuje odlišit izomery a zvýšit citlivost i rychlost detekce peptidů s posttranslačními modifikacemi.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo porovnat výkon PASEF na Bruker timsTOF Pro a DDA na Thermo Q-Exactive HF-X pro analýzu glykosylovaných a fosforylovaných peptidů. Dále se zkoumalo, nakolik ion mobility dokáže oddělit strukturální a poziční izomery v komplexních vzorcích:

• lidská plazma před obohacením o glykopeptidy
• celulární lyzát HeLa s TiO₂-obohacenými fosfopeptidy

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly redukovány, alkylovány a trypticky digesovány. Glykopeptidy se izolovaly pomocí lectinového obohacení, fosfopeptidy pomocí TiO₂. Oddělení probíhalo na nanoRPLC 90–130 min s PASEF na timsTOF Pro a s DDA na Q-Exactive HF-X. Data se vyhledávala v ByonicTM proti lidskému proteomu s proměnnými PTM (glykanové i fosfo-modifikace).

Instrumentace:

• Bruker timsTOF Pro se sekvencováním PASEF
• Thermo Q-Exactive HF-X Orbitrap

Hlavní výsledky a diskuse

Citlivost a počet identifikací:

• timsTOF Pro: 439 055 MS2, 5 201 proteinů (1 % FDR), 92 873 PSM, 32 957 peptidů
• Q-Exactive HF-X: 73 551 MS2, 4 119 proteinů (1 % FDR), 37 307 PSM, 21 978 peptidů

Optimalizace kolizních energií u glykopeptidů ukázala lepší výkon při 32–64 eV než při 31–51 eV. V RPLC s každou sialovou jednotkou se retenční čas peptidu prodlouží o několik minut. Ion mobility rozlišila některé glykosidické izomery (např. SA2), které vykazovaly širší rozptyl mobilit než obyčejné peptide. Vnitřní rozpad (in-source decay) však může zkreslovat stanovení retenčního času a kvantifikaci.
U fosfopeptidů umožnila dimenze mobility doplňkové oddělení pozičních izomerů, přestože retence zůstává účinnější. Ve vybraných případech se mobilita osvědčila pro rozlišení koelujících izomerů.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zlepšení citlivosti a hloubky proteomické analýzy glyko- i fosfopeptidů
• Dodatečná dimenze separace izomerů založená na kolizním průřezu
• Aplikace v biomarkerovém výzkumu, vývoji léčiv a QA/QC v biotechnologiích

Budoucí trendy a možnosti využití

• Detailnější charakterizace struktur glykánových izomerů pomocí ML-modelů
• Integrace mobility s dalšími technikami (např. ion-swap, ETD) pro komplexní proteomiku
• Rozvoj kvantitativních protokolů pro PTM-targetované klinické studie

Závěr

Široké využití TIMS-TOF Pro s PASEF potvrzuje přínos oddělení izomerů a vysoké citlivosti pro glyko- a fosfoproteomiku. I když mobilita ne vždy překoná retenční čas, poskytuje cennou doplňkovou informaci pro analýzu komplexních modifikací peptidů.

Reference

• Zhu Y., Royle L., Leary J. A. Ion mobility separation of glycopeptide isomers. J Am Soc Mass Spectrom. 2015; PMID: 25840811.