Comprehensive Analysis of IgE Glycoforms by FAIMS-LC-MS/MS using Orbitrap Eclipse Mass Spectrometer

Význam tématu

Profilování glykosylace IgE je zásadní pro pochopení mechanismů alergických reakcí a vývoj biopharmak. N-glykosylace ovlivňuje stabilitu a funkci imunoglobulinů a její podrobná charakterizace vyžaduje citlivé analytické postupy s vysokým rozlišením a selektivitou. FAIMS-LC-MS/MS kombinované s Orbitrap Eclipse poskytuje pokročilou separaci a detekci glykosylovaných peptidů bez nutnosti obohacení vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo důkladně identifikovat a charakterizovat sedm N-glykozylovaných míst v lidském IgE a jejich mikroheterogenní glykofomové profily. Využitím FAIMS Pro s optimalizovanými kompenzačními napětími (CV) ve spojení s Orbitrap Eclipse MS byly porovnány metody s a bez FAIMS a zhodnocena efektivita jednotlivých CV v rozsahu od -30 do -60 V.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky IgE byly redukovány, alkylovány a tráveny enzymy LysC/trypsin a chymotrypsinem. Peptidy byly separovány pomocí reversed phase LC na systému EASY-nLC 1200 s EASY-Spray kolonkou (50 cm, 75 μm) při gradientu 5–40 % ACN za 120 minut. Detekce probíhala na Thermo Scientific Orbitrap Eclipse Tribrid MS s FAIMS Pro rozhraním. Použity byly režimy DDA s FT HCD a EThcD fragmentací. Data analyzována v Proteome Discoverer 2.4 (Byonic, Byologic), BioPharma Finder 4.0 a ProSightPC 4.1.

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo potvrzeno všech sedm N-glykozylovaných míst v IgE včetně částečně glykozylovaných pozic N383 a klíčové N394. Interní FAIMS stepping mezi -45 a -60 V přineslo nejvyšší počet PSM a unikátních glykofomů. Nižší CV (< -60 V) vedla k odtržení sialových zbytků. Nebyl pozorován jednoznačný trend mezi CV a složením glykanu, avšak S/N spekter bylo ve FAIMS výrazně lepší. ETD fragmentace poskytla spolehlivou identifikaci glykosylovaných zbytků i při vícečetné glykosylaci peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

FAIMS-LC-MS/MS workflow umožňuje komplexní profilování glykofomů bez nutnosti předchozího obohacení či frakcionace. Zvýšená selektivita a dynamický rozsah usnadňuje studium mikroheterogenity v biotechnologicky důležitých proteinech a může být implementována v QA/QC procesech a klinickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření FAIMS aplikace na další třídy imunoglobulinů a glykoproteinů
• Integrace s novými ion mobility technikami pro lepší separaci izomerů
• Automatizace CV stepping a vývoj cílených kvantifikačních metod
• Vysokopropustné platformy pro screening glykosylace v bioreaktorech

Závěr

Optimalizované FAIMS-LC-MS/MS na Orbitrap Eclipse významně zlepšuje identifikaci a kvantifikaci glycoformů IgE. Interní stepping mezi -45 a -60 V poskytuje nejlepší výsledky bez potřeby glykoproteinového obohacení. Metoda představuje efektivní nástroj pro detailní studium glykosylace v biologických i biotechnologických aplikacích.

Reference

• Hebert AS, Prasad S, Belford MW, et al. Comprehensive Single-Shot Proteomics with FAIMS on a Hybrid Orbitrap Mass Spectrometer. Anal Chem. 2018;90(15):9529–9537.
• Pfammatter S, Bonneil E, McManus FP, et al. A Novel Differential Ion Mobility Device Expands the depth of Proteome Coverage and the Sensitivity of Multiplex Measurements. Mol Cell Proteomics. 2018;17(10):2051-2067.
• Alving K, Alving A, Wang B. Determination of Human Immunoglobulin Glycoforms by timsTOF Pro Sequencing Analysis. ASMS 2019; WP 348.
• Wu G, Hitchen PG, Panico M, et al. Glycoproteomic studies of IgE from a novel hyper IgE syndrome linked to PGM3 mutation. Glycoconj J. 2016;33(3):447-456.
• Shade KT, et al. A single glycan on IgE is indispensable for initiation of anaphylaxis. J Exp Med. 2015;212(4):457–467.
• Plomp R, et al. Recent Advances in Clinical Glycoproteomics of Immunoglobulins. Mol Cell Proteomics. 2016;15(8):2217–2228.