Robust Capillary and Low-Microflow LC-MS with Improved Acidic Peptide Recovery Using BioResolve™ 300 μm ID Columns

Význam tématu

Capilární a nízkoprůtoková LC-MS se stávají klíčovými v proteomice díky lepšímu poměru signál/šum a nižšímu odběru vzorku. Pro analýzy peptidů s kyselými zbytky a fosforylovaných peptidů jsou kritické interakce analyzátů s kovovým hardwarem kolony, které mohou vést ke ztrátám, prodlouženému ostření píků a zvýšené variabilitě. Technologie MaxPeak HPS (High Performance Surfaces) v BioResolve 300 µm ID kolónách cílí na potlačení těchto nežádoucích vazeb a tím zlepšení citlivosti a reprodukovatelnosti nízkoprůtokových proteomických pracovních postupů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo porovnat výkon Waters BioResolve Peptide 300 µm ID kolón s MaxPeak Premier (HPS) technologií vůči obdobným nerezovým nanoEase kolónám pro LC-MS proteomiku, se zaměřením na:

• obnovu a tvar píků kyselých a fosforylovaných peptidů,
• potřebu kondicionace kolony,
• špičkovou kapacitu a mezikolonovou reprodukovatelnost.

Testovacím materiálem byl komerční MassPREP Enolase Digest s přidanými fosfopeptidy; sledovány byly vybrané peptidové sekvence včetně silně kyselého T51 a fosforylovaného T19p.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika byla navržena pro capilární / nízkoprůtokové separace:

• Vzorek: MassPREP Enolase Digest with Phosphopeptides Mix, rekonstituován v 0,1 % kyselině mravenčí (HCOOH).
• Kolony: Waters BioResolve Peptide C18 RP, MaxPeak Premier Technology, 1.7 µm, 300 Å, BEH, 0.3 x 50 mm (p/n: 186011501) a pro srovnání nanoEase M/Z Peptide BEH C18 0.3 x 50 mm (p/n: 186009263).
• LC systém a spojení: ACQUITY UPLC M‑Class s použitím ZenFit tubing (různé ID pro propojení µSM, µBSM a zdroj MS) a odbočením toku přímo z kolony do MS.
• Mobilní fáze: A = 0.1 % HCOOH ve vodě, B = 0.1 % HCOOH v acetonitrilu. Teplota kolony 60 °C, teplota vzorku 6 °C, injekční objem 0.5 µL.
• MS detektor: Xevo G3, ESI+ low-flow probe, rozsah 50–2000 m/z, capillary 2.50 kV, cone volt 30 V, desolvation 250 °C; datový software MassLynx a waters_connect pro zpracování.
• Spotřební materiál: QuanRecovery vials pro minimalizaci adsorpce do skla/plastu.
• Výpočty: špičková kapacita byla stanovena pomocí 4σ metody.

Hlavní výsledky a diskuse

• Minimální kondicionace: BioResolve kolona s HPS vykazovala téměř shodné TIC pro 1. a 10. injekci, což indikuje malou potřebu předběžného kondicionování. Nerezová nanoEase kolona ukázala výrazné zvýšení intenzit mezi 1. a 10. injekcí, což je typické pro počáteční interakce peptidů s kovovým povrchem.
• Zlepšená obnova kyselých peptidů: Extrahované iontové chromatogramy pro silně kyselý peptid T51 prokázaly výrazně vyšší signál již v první injekci na BioResolve oproti nerezové kolóně, kde byla počáteční obnova velmi nízká a krování se zlepšilo až po opakovaných injekcích.
• Lepší tvar píků pro fosfopeptidy: Fosforylovaný peptid T19p vykazoval výrazné zkrácení ocasení (redukce tailingu) na HPS kolóně oproti nerezové v prvních injekcích; u nerezové kolony se přijatelné tvary dosáhly až po několika injekcích.
• Špičková kapacita a intenzita: Po dostatečném kondicionování vykazovaly obě kolony srovnatelnou kapacitu, avšak BioResolve nabízel lepší počáteční signál a vyšší reprodukovatelnost bez nutnosti dlouhého „zabilancování“ kolony.
• Mezikolonová reprodukovatelnost: Test na třech BioResolve kolónách ukázal výbornou reprodukovatelnost s RSD <1 % pro relativní retenční časy a RSD <5 % pro relativní plošné intenzity vybraných peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená citlivost a spolehlivost pro analýzy kyselých a fosforylovaných peptidů, což je důležité pro PTM‑mapování a kvantitativní proteomiku při omezeném množství vzorku.
• Snížení doby a solventní spotřeby díky možnostem práce v nízkém průtoku (capillary / low‑microflow), tedy i ekologičtější provoz laboratoríí.
• Méně času stráveného přípravou a kondicionací kolony zlepšuje průchodnost analytických běhů v rutinních i vysokopropustných provozech.
• Vysoká mezi‑kolonová reprodukovatelnost podporuje přenositelnost metod mezi laboratořemi a zvyšuje důvěryhodnost kvantitativních výsledků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Širší adopce capilárních a nízkoprůtokových pracovních postupů v klinické a průmyslové proteomice, kde jsou vstupní vzorky omezené.
• Rozšíření povrchových úprav HPS na další typy hardware a větší škálu průměrů kolón, aby se zlepšila kompatibilita se širokým spektrem analyzovaných molekul (např. silně adhezívní PTM nebo metabolity).
• Integrace s technikami jako IM‑MS (ion mobility) a vysoce‑citlivými analyzátory pro hlubší profilování PTM a nízkoho-abundance proteinů.
• Optimalizace povrchových technologií za účelem dalšího snížení nespecifické adsorpce a pro zrychlení přechodu na „greener“ chromatografii s nízkou spotřebou rozpouštědel.
• Standardizace a benchmarking mezi výrobci a sítěmi laboratoří pro lepší přenositelnost metod a validaci kvantitativních workflow.

Závěr

BioResolve Peptide 300 µm ID kolony s MaxPeak Premier (HPS) technologií přinášejí významné výhody pro capilární a nízkoprůtokovou LC‑MS proteomiku zaměřenou na kyselé a fosforylované peptidy: zlepšenou počáteční obnovu analyzátů, ostřejší a méně zrepovaná rozdělení píků, nižší potřebu kondicionace a vynikající mezi‑kolonovou reprodukovatelnost. Tyto vlastnosti usnadňují rutinní nasazení citlivých proteomických analýz a zvyšují kvalitu kvantitativních výsledků.

Reference

1. Bian Y., Gao C., Kuster B. On the Potential of Micro-Flow LC-MS/MS in Proteomics. 2022;19(3):153–164.
2. Lennon S.; et al. High-Throughput Microbore Ultrahigh-Performance Liquid Chromatography-Ion Mobility-Enabled-Mass Spectrometry-Based Proteomics Methodology for the Exploratory Analysis of Serum Samples from Large Cohort Studies. J. Proteome Res. 2021;20(3):1705–1715.
3. Zurawska M., Basik M., Aguilar-Mahecha A., Dadlez M., Domanski D. A Micro-Flow, High-pH, Reversed-Phase Peptide Fractionation and Collection System for Targeted and In-Depth Proteomics of Low-Abundance Proteins in Limiting Samples. Methods. 2023;11:102306.
4. Berthelette K., Collins C., Walter T. H. Improving Sensitivity and Analytical Method Greenness using MaxPeak™ Premier 1.0 mm Internal Diameter Columns. Waters Application Note. 720009221. January 2026.
5. Hanna C. M., Koza S. M., Addepalli B. Enhanced Recovery and Peak Shape of Acidic Peptides with BioResolve™ 1 mm ID Columns with MaxPeak™ Premier Technology. Waters Application Note. 720009231. February 2026.
6. Hanna C. M., Koza S. M., Addepalli B. Benchmarking Resolution and Recovery of BioResolve™ 1 mm ID C18 RP Columns with MaxPeak™ Premier Technology. Waters Application Note. 720009274. March 2026.
7. Nguyen J. M., Rzewuski S. C., Lauber M. A. Enhancing Phosphopeptide Quantitation Using ACQUITY Premier Peptide CSH C18 Columns. Waters Application Note. 720007211. March 2021.
8. Reed C., Hong P., Wong N., Birdsall R. E. Improving Peptide Mapping Separations Containing Phosphopeptides Using MaxPeak™ Premier Column Technology on an ACQUITY™ Premier System. Waters Application Note. 720008136. December 2023.