Convenient and Reliable Analysis of Antibody Drug Conjugates

Význam tématu

Antibody–drug conjugates (ADCs) představují významnou třídu bioterapeutik spojujících monoklonální protilátky s vysoce účinnými cytotoxickými látkami. Přesné stanovení průměrného počtu léčivých molekul navázaných na molekulu protilátky (DAR) je klíčové pro zajištění bezpečnosti, účinnosti a reprodukovatelnosti výroby ADCs.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem studie bylo demonstrovat analýzu brentuximabu vedotinu (Adcetris) metodou hydrophobní interakční chromatografie (HIC) s ternárním gradientem obsahujícím isopropanol. Studie hodnotila schopnost separovat pět hlavních DAR druhů (D0–D8), kvantifikovat jejich podíly a ověřit reprodukovatelnost výsledků.

Použitá metodika a instrumentace

Pro eluční gradient byly použity tři mobilní fáze: A) 1,5 M síran amonný v 50 mM fosfátovém pufru pH 7, B) 50 mM fosfátový pufr pH 7, C) isopropanol. Gradient byl nastaven od 55 % A, 40 % B, 5 % C do 0 % A, 75 % B, 25 % C v průběhu 25 minut. Teplota kolony 25 °C, průtok 0,4 mL/min, detekce při 280 nm.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity II Prime Bio LC sestava: Bio Flexible Pump (G7131C), Bio Multisampler (G7137A) s termostatem, Multicolumn Thermostat (G7116B), Variable Wavelength Detector (G7114B)
• Agilent OpenLab CDS verze 2.5 nebo novější
• Analytická kolona Agilent AdvanceBio HIC 3,5 µm, 4,6 × 100 mm

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila čistou separaci pěti DAR druhů D0–D8 s velmi nízkou odchylkou retenčních časů (RSD < 0,055 %) a vysokou precizností ploch píků (RSD < 0,46 %, s výjimkou nejvyššího DAR). Výsledné procentuální zastoupení jednotlivých druhů vedlo k průměrnému DAR ~3,3. Robustnost quaternárního čerpadla pro práci s kombinací vysokoslaných pufrů a organických modifikátorů prokázala vynikající výkonnost i při opakovaných bězích.

Přínosy a praktické využití metody

• Spolehlivá kvantifikace DAR pro kontrolu kvality ADCs
• Vysoká reprodukovatelnost výsledků i pro náročné složení mobilních fází
• Možnost rutinního nasazení v biofarmaceutických laboratořích

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření použití ternárních gradientů v biochemické chromatografii pro komplexní biomolekuly. Dalšími směry jsou automatizace metodiky, integrace s hmotnostní spektrometrií pro detailní charakterizaci a optimalizace podmínek pro různé typy ADC konstrukcí.

Závěr

Popisovaná metoda HIC s ternárním gradientem a isopropanolem na systému Agilent 1260 Infinity II Prime Bio LC poskytuje robustní, vysoce reproducibilní stanovení DAR u brentuximabu vedotinu. Vysoká spolehlivost a přesnost činí tento přístup vhodným pro rutinní QC a výzkum ADCs.

Reference

1. McCombs JR; Owen SC. Antibody Drug Conjugates: Design and Selection of Linker, Payload and Conjugation Chemistry. J. Amer. Assoc. Pharm. Sci. 2015, 17(2): 339–351.
2. Rodriguez-Aller M et al. Practical Method Development for the Separation of Monoclonal Antibodies and Antibody-Drug-Conjugate Species in Hydrophobic Interaction Chromatography, Part 1: Optimization of the Mobile Phase. J. Pharm. Biomed. Anal. 2016, 118: 393–403.