High Salt—High Reproducibility - Analysis of antibody drug conjugates using hydrophobic interaction chromatography with the Agilent 1290 Infinity II Bio LC System

Význam tématu

Antibody-drug conjugáty (ADC) kombinují specifickou protilátku s cytotoxickým lékem a jsou klíčové pro cílenou onkologickou terapii. Určení poměru lék–protilátka (DAR) ovlivňuje účinnost a bezpečnost ADC. Hydrofobní interakční chromatografie (HIC) je standardní nondenaturační metoda pro rozlišení ADC podle počtu připojených molekul léku.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo demonstrovat spolehlivou analýzu brentuximabu vedotinu (Adcetris) pomocí HIC na systému Agilent 1290 Infinity II Bio LC. Studie se zaměřila na:

• separaci populačních frakcí ADC dle počtu nukleotidů navázaného léku,
• výpočet průměrného DAR,
• posouzení opakovatelnosti retence a ploch chromatografických signálů,
• využití softwarové funkce „Blank Subtraction“ pro stabilizaci baseline.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II Bio High-Speed Pump (G7132A) s bezželeznou cestou toku vhodnou pro silné soli
• Agilent 1290 Infinity II Bio Multisampler (G7137A) s termostatem vzorků
• Agilent 1290 Infinity II Multicolumn Thermostat (G7116B) se standardním biokompatibilním výměníkem tepla
• Agilent 1290 Infinity II Variable Wavelength Detector (G7114B), 280 nm, mikroflow cell 2 µL
• Software Agilent OpenLab CDS Version 2.5

Použitá metodika

Pro separaci bylo použito sloupce Agilent AdvanceBio HIC, 3,5 µm, 4,6 × 100 mm. Mobilní fáze A obsahovala 1,5 M amonný síran v 50 mM fosfátovém pufru (pH 7), fáze B stejný pufr s 20 % isopropanolem. Gradient probíhal od 30 % do 100 % fáze B během 30 min, tok 0,4 mL/min, teplota 25 °C. Vzorky obsahující ADC při koncentraci 100 mg/mL byly injektovány objemem 15 µL při 10 °C. Pro odstranění driftu baseline posloužila funkce Blank Subtraction ve zpracování chromatogramu.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza odhalila pět hlavních píků odpovídajících ADC s 0, 2, 4, 6 a 8 molekulami léku (označení D0–D8). Po integraci ploch píků byl vypočten průměrný DAR 3,7, v souladu s literaturou. Opakovatelnost retence (RSD < 0,081 %) a ploch (RSD < 0,282 %) potvrdila vysokou stabilitu metody. Aplikace Blank Subtraction významně zlepšila kvalitu integrace filtrací driftu způsobeného méně čistým amonným síranem.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a nondenaturační stanovení DAR s vysokou přesností.
• Biokompatibilní bezželezná konstrukce LC systému zabraňuje korozi při použití vysokých koncentrací solí.
• Software pro korekci baseline umožňuje pracovat s běžnými laboratorními solemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření automatizace a integrace HIC s hmotnostní spektrometrií pro detailnější charakterizaci ADC. Dalším krokem je vývoj rychlejších kolonek se zkrácenými analytickými časy a nasazení pokročilých softwarových algoritmů pro automatické vyhodnocení složitých profilů ADC.

Závěr

Studie potvrdila, že Agilent 1290 Infinity II Bio LC ve spojení s OpenLab CDS nabízí robustní platformu pro spolehlivou determinaci DAR u ADC. Vysoká reprodukovatelnost, odolnost proti solným podmínkám a funkcionalita pro odstranění baseline driftu poskytují nejvyšší důvěru v získaná data.

Reference

1. McCombs J. R., Owen S. C. Journal of Pharmaceutical Sciences 2015, 17(2), 339–351.
2. Marcoux J. et al. Protein Science 2015, 24, 1210–1223.
3. Younes A. et al. New England Journal of Medicine 2010, 363(19), 1812–1821.
4. Schneider S. Agilent Application Note 2017, publ. 5991-8493EN.
5. Wakankar A. et al. mAbs 2011, 3(2), 161–172.
6. Rodriguez-Aller M. et al. J. Pharm. Biomed. Anal. 2016, 118, 393–403.