Improved Recovery and Peak Shape of Sialylated O-glycopeptides of Erythropoietin (EPO) with ACQUITY Premier CSH Column

Význam tématu

Peptidové mapování pomocí LC–MS je klíčovou technikou pro potvrzení sekvence proteinů, analýzu posttranslačních modifikací a relativní kvantifikaci. Sialylované O-glykopeptidy jsou obzvláště citlivé na nespecifickou adsorpci na kovové povrchy v chromatografických systémech, což vede k poklesu zotavení analytu a deformaci tvaru píků. Efektivní potlačení těchto interakcí je zásadní pro přesnou, citlivou a reprodukovatelnou analýzu biotechnologických léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované aplikace bylo porovnat chromatografickou výkonnost kolony ACQUITY Premier CSH s povrchovou úpravou MaxPeak HPS proti standardní diskusšeděné CSH kolóně z nerezové oceli. Jako modelový analyzát byl zvolen erytropoetin (EPO) s jedinou O-glykosylací (peptid T13) ve formě aglykosylované, jednoky a dvousialylované glykoformy. Studie hodnotila zotavení, tvar píků a reprodukovatelnost retence.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický workflow:

• Příprava vzorku: denaturace, redukce, alkylace a trypsinová digesce vzorku biosimilární EPO.
• Instrumentation: BioAccord System složený z ACQUITY UPLC I-Class, ACQUITY RDa detektoru a dvou typů kolón CSH C18, 130 Å, 1,7 µm (2,1×100 mm): Premier s MaxPeak HPS a ekvivalentní z nerezové oceli.
• Chromatografie: mobilní fáze A – voda s 0,1 % kyselinou fór­movou, B – acetonitril s 0,1 % kyselinou fór­movou; gradient 1–35 % B během 50 minut při 60 °C; dávka 0,5 µg.
• MS detekce: pozitivní ESI režim, m/z 50–2 000; kapilární napětí 1,2 kV, kuželové napětí 30 V, teplota desolvatace 350 °C, energie kolizního rampování 60–120 V v režimu DIA.

Hlavní výsledky a diskuse

Použití kolony s povrchovou úpravou MaxPeak HPS vedlo k významnému zvýšení celé řady parametrů:

• Zotavení O-glykopeptidů se zvýšilo nejméně 2,5násobně ve srovnání s nerezovou kolónou, u dvousialylované formy až 4násobně.
• Tvar píků dvousialylovaného peptidu se přiblížil Gaussově křivce, asymetrie poklesla z As ≈ 6 na As ≈ 1, což umožňuje spolehlivou integraci a přesnější relativní kvantifikaci.
• Relativní kvantifikace glykoform T13 na Premier kolóně lépe korelovala s výsledky z analýzy intact EPO po de-N-glykosylaci, což potvrzuje věrnost skladby vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda s ACQUITY Premier kolónou s MaxPeak HPS nabízí:

• Omezení nespecifické adsorpce na kovové povrchy.
• Zvýšenou citlivost a vyšší detekční signál.
• Lepší symetrii a opakovatelnost chromatografických píků.
• Přesnější relativní kvantifikaci posttranslačních modifikací.
• Vhodnost pro rutinní kontrolu kvality a výzkum biotechnologických proteinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Výhody povrchově upravených kolón mohou být rozšířeny na další kyselé posttranslační modifikace, jako jsou fosforylace nebo jiné glykoformy. Očekává se širší nasazení v oblasti vývoje bioléčiv, v QA/QC laboratořích a v klinických bioanalytických aplikacích, kde je kladen důraz na citlivost, robustnost a reprodukovatelnost analýzy.

Závěr

ACQUITY Premier kolona s technologií MaxPeak HPS významně redukuje adsorpční artefakty u sialylovaných O-glykopeptidů, zvyšuje zotavení analytů a optimalizuje tvar chromatografických píků. Tím umožňuje přesnější a reprodukovatelnou charakterizaci glykoproteinů, což je klíčové pro kvalitativní i kvantitativní analýzy biopharmaceuticals.

Reference

• 1. Koshel B, Simeone J, Dao D et al. Bypassing LC System Passivation Requirements Using ACQUITY Premier Column with MaxPeak HPS Technology for the Recovery of a Phosphorylated Peptide. Waters Application Note, May 2020.
• 2. Birdsall RE, Kellet J, Ippoliti S et al. Increasing Chromatographic Performance of Acidic Peptides in RPLC-MS-based Assays with ACQUITY Premier Column featuring MaxPeak HPS Technology. Waters Application Note, Sept 2020.
• 3. Lauber MA, Walter TH, Gilar M et al. Low Adsorption HPLC Columns Based on MaxPeak High Performance Surfaces. Waters White Paper, Oct 2020.
• 4. CarboMet. Case Study 2 – Erythropoeitin (EPO). University of Manchester, Accessed Feb 19, 2021.