METODY STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ AKTIVITY PŘÍRODNÍCH LÁTEK IN VITRO

Význam tématu

Oxidační stres vyvolávaný reaktivními kyslíkovými a dusíkovými radikály poškozuje biomolekuly (lipidy, bílkoviny, nukleové kyseliny) a je příčinou celé řady civilizačních onemocnění (kardiovaskulární choroby, karcinogeneze, stárnutí). Antioxidanty z potravin rostlinného i živočišného původu představují účinnou prevenci tohoto poškození. In vitro testy antioxidační aktivity umožňují rychlou charakterizaci účinnosti jednotlivých sloučenin i komplexních extraktů a přispívají k výběru kandidátů pro další biologické studie.

Cíle a přehled studie / článku

Článek nabízí systematický přehled nejčastěji používaných metod stanovení antioxidační aktivity přírodních látek a složitých směsných vzorků. Cílem je představit principy jednotlivých postupů, jejich výhody a omezení, abychom mohli volit vhodné assay pro hodnocení čistých antioxidantů i extraktů potravin a rostlin.

Použitá metodika a instrumentace

Metody jsou rozděleny do dvou hlavních skupin:

• Metody založené na eliminaci volných radikálů:
  
  • ABTS / TEAC (kation-radikál ABTS•+ vzniká enzymatickou či chemickou oxidací; antioxidační kapacita vyjádřena jako ekvivalent Troloxu)
  • DPPH (reakce s difenylpikrylhydrazylovým radikálem, sledování poklesu absorbance při 517 nm)
  • Galvinoxyl (redukovatelný stabilní radikál EH-pheyloxylu)
  • Fremyho sůl (využití nitrosodisulfonanu draselného a detekce ESR)
  • ORAC (generace peroxylových a hydroxylových radikálů, sledování úbytku fluorescence sondy – fykoerytrin či fluorescein)
  • Metody pro hydroxylové (Fentonova reakce, UV fotolýza) a superoxidové radikály (xanthin/xanthinoxidasa, chemiluminiscence luminolu) a pro inhibici lipidové peroxidace (linolová kyselina, β-karoten, TBA-MDA).
• Metody založené na hodnocení redoxních vlastností:
  
  • FRAP (měření redukce Fe3+-TPTZ komplexu na Fe2+-TPTZ při 593 nm)
  • Cyklická voltametrie (určení oxidačního potenciálu a odštěpovaného proudu)
  • HPLC-ECD (elektrochemická detekce antioxidantů podle aplikačního potenciálu)

Instrumentace zahrnovala spektrofotometry UV/VIS, fluorescenční mikrotitrační čtečku, ESR spektrometr, fluorimetr, HPLC s UV a elektrochemickou detekcí, chemiluminiscenční detektor, tenkovrstevnou chromatografii (TLC) a mikrotitrační destičky.

Hlavní výsledky a diskuse

Každá metoda postihuje jen určitý typ antioxidačního působení (např. radikál-specifické assay, schopnost redukce kovů, zastavení lipidové peroxidace). Některé postupy lépe pracují v hydrofilním prostředí, jiné dokážou testovat lipofilní antioxidanty. Studie ukazují vzájemné korelace výsledků z různých assay, ale i kritická omezení, např. artefakty při nízkém pH (FRAP) nebo interference barevnými vzorky (řešeno HPLC-ECD). Významné jsou také rozdíly mezi in vitro kapacitou a skutečnou biologickou účinností in vivo, ovlivněnou biodostupností a metabolismem.

Přínosy a praktické využití metody

Komplexní přehled metod usnadňuje:

• rychlý screening nových antioxidantů a výběr perspektivních látek
• standardizaci a kontrolu kvality rostlinných extraktů a potravních doplňků
• stanovení vztahu struktura–aktivita u polyfenolů
• porovnání antioxidačních parametrů potravinových vzorků

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj multiplexních high-throughput assay na mikrotitračních destičkách, kombinace chromatografických separací s online detekcí radikálů, začlenění modelových biologických membrán a in vitro trávicích simulací, integrace in vivo biomarkerů oxidačního stresu a pokročilá elektrochemická detekce pro komplexní profilaci antioxidantů.

Závěr

Žádná jednotlivá metoda nedokáže plně pokrýt všechny mechanizmy antioxidačního působení v organismu. Optimální hodnocení vyžaduje kombinaci technik zaměřených na radikálové zhášení, prevenci lipidové peroxidace a redoxní kapacitu, s ohledem na biologickou relevanci a farmakokinetiku testovaných látek.

Reference

1. Halliwell B.: Free Radical Res. Commun. 9, 1 (1990).
2. Rice-Evans C., Miller N. J., Paganga G.: Free Radical Biol. Med. 20, 933 (1996).
3. Arnao M. B., Cano A., Acosta M.: Recent Res. Dev. Agric. Food Chem. 2, 893 (1998).
4. Miller N. J., Rice-Evans C.: Redox Rep. 2, 161 (1996).
5. Rice-Evans C., Miller N. J., Bolwell P. G., Bramley P. M., Pridham J. B.: Free Radical Res. 22, 375 (1995).
6. Arnao M. B., Cano A., Acosta M.: Food Chem. 73, 239 (2001).
7. Re R., Pellegrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M., Rice-Evans C.: Free Radical Biol. Med. 26, 1231 (1999).
8. Miller N. J., Sampson J., Candeias L. P., Bramley P. M., Rice-Evans C. A.: FEBS Lett. 384, 240 (1996).
9. Cano A., Hernández-Ruiz J., Garcia-Canovas F., Acosta M., Arnao M. B.: Phytochem. Anal. 9, 196 (1998).
10. Cano A., Acosta M., Arnao M. B.: Redox Rep. 5, 365 (2000).
11. Verhagen J. V., Haenen G. R. M. M., Bast A.: J. Agric. Food Chem. 44, 3733 (1996).
12. Koleva I. I., Niederländer H. A. G., van Beek T. A.: Anal. Chem. 73, 3373 (2001).
13. Blois M. S.: Nature 181, 1199 (1958).
14. Yokozawa T., Chen C. P., Dong E., Tanaka T., Nonaka G. I., Nishioka I.: Biochem. Pharmacol. 56, 231 (1998).
15. Espin J. C., Soler-Rivas C., Wichers H. J.: J. Agric. Food Chem. 48, 648 (2000).
16. Du Toit R., Volsteedt Y., Apostolides Z.: Toxicology 166, 63 (2001).
17. Nanjo F., Goto K., Seto R., Suzuki M., Sakai M., Hara Y.: Free Radical Biol. Med. 21, 895 (1996).
18. Yamaguchi T., Takamura H., Matoba T., Terao J.: Biosci., Biotechnol., Biochem. 62, 1201 (1998).
19. Choi H. S., Song H. S., Ukeda H., Sawamura M.: J. Agric. Food Chem. 48, 4156 (2000).
20. Koleva I. I., Niederländer H. A. G., van Beek T. A.: Anal. Chem. 72, 2323 (2000).
21. Shi H., Noguchi N., Niki E.: Methods in Enzymology 157 (Academic Press, 2001).
22. Pedersen C. B. et al.: Eur. J. Clin. Nutr. 54, 405 (2000).
23. Cao G., Sofic E., Prior R.: J. Agric. Food Chem. 44, 3426 (1996).
24. Cao G., Sofic E., Prior R. L.: Free Radical Biol. Chem. 22, 749 (1997).
25. Ou B., Hampsch-Woodill M., Prior R. L.: J. Agric. Food Chem. 49, 4619 (2001).
26. Yoshioka H., Ohashi Y., Akaboshi M., Senba Y., Yoshioka H.: Free Radical Res. 35, 265 (2001).
27. Husain S. R., Cillard J., Cillard P.: Phytochemistry 26, 2489 (1987).
28. Matsugo S., Kayamori N., Ohta T., Konishi T.: Chem. Pharm. Bull. 39, 545 (1991).
29. Paulová H., Bochořáková H., Slanina J., Táborská E.: Pharm. Pharmacol. Lett. 10, 27 (2000).
30. Halliwell B., Gutteridge J. M. C., Aruoma O. I.: Anal. Biochem. 165, 215 (1987).
31. Tsai Ch. H. et al.: J. Agric. Food Chem. 49, 2137 (2001).
32. Robak J., Gryglewski R. J.: Biochem. Pharmacol. 37, 837 (1988).
33. Lu Y., Foo L. Y.: Food Chem. 75, 197 (2001).
34. Wood J. E. et al.: Food Chem. 77, 155 (2002).
35. Unno T. et al.: Food Chem. 76, 259 (2002).
36. Dapkevicius A., van Beek T. A., Niederländer H. A. G.: J. Chromatogr., A. 912, 73 (2001).
37. Tsuda T. et al.: J. Agric. Food Chem. 42, 2407 (1994).
38. Quinlan G. J., Halliwell B., Moorhouse C. P., Gutteridge J. M. C.: Biochim. Biophys. Acta 962, 126 (1988).
39. Yokozawa T. et al.: Phytother. Res. 11, 446 (1997).
40. Mathiesen L., Malterud K. E., Sund R. B.: Planta Med. 61, 515 (1995).
41. Yamanaka N., Oda O., Nagao S.: FEBS Lett. 405, 186 (1997).
42. Rapisarda P. et al.: J. Agric. Food Chem. 47, 4718 (1999).
43. Terao J., Piskula M., Yao Q.: Arch. Biochem. Biophys. 308, 278 (1994).
44. Yen G. Ch., Hsieh Ch. L.: J. Agric. Food Chem. 46, 3952 (1998).
45. Pratt D. E., Miller E. E.: J. Am. Oil Chem. Soc. 61, 1064 (1984).
46. Miller H. E.: J. Am. Oil Chem. Soc. 48, 91 (1971).
47. Fukumuto L. R., Mazza G.: J. Agric. Food Chem. 48, 3597 (2000).
48. Daglia M. et al.: J. Agric. Food Chem. 48, 1449 (2000).
49. Haenen G. R. M. M., Bast A.: FEBS Lett. 159, 24 (1983).
50. Van der Sluis A. A. et al.: J. Agric. Food Chem. 48, 4116 (2000).
51. Nielsen F. et al.: Clin. Chem. 43, 1209 (1997).
52. Ou B. et al.: J. Agric. Food Chem. 50, 1322 (2002).
53. Rapta P. et al.: Free Radical Biol. Med. 18, 901 (1995).
54. Nakamura T. et al.: Chem. Pharm. Bull. 46, 1388 (1998).
55. Peyrat-Maillard M. N. et al.: Talanta 51, 709 (2000).