An Easy and Fast Approach for Monoclonal Antibody N-linked Glycan Analysis from Sample Preparation to Data Analysis

Význam tématu

Monoklonální protilátky patří mezi nejrychleji se rozvíjející biologické léčiva. N-glykany na těchto molekulách ovlivňují jejich biologickou aktivitu, stabilitu a imunitní reakce. Kontrola glykozylace je proto klíčová pro zajištění kvality a konzistence výroby léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout zjednodušený a rychlý workflow pro analýzu N-glykanů na monoklonálních protilátkách, který zkrátí přípravu vzorku z několika dnů na dobu kratší než tři hodiny. Použití S-Bio EZGlycoTM mAb-N kitu spolu s UHPLC systémem Shimadzu Nexera mělo prokázat zvýšenou efektivitu a reprodukovatelnost.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek tvořil biosimilární bevacizumab 1 mg/mL v prostředí Milli-Q vody. Workflow zahrnovalo:

• uvolnění N-glykanů pomocí S-Bio EZGlycoTM mAb-N kitu (do 3 h),
• fluorescenční značení 2-aminobenzamidem (2-AB),
• čisticí krok a rozpuštění značených glykánů v 100 μL 50% acetonitrilu.

Instrumentace:

• UHPLC Shimadzu Nexera s kolonkou HALO Glycan (150×2,1 mm, 2,7 μm),
• gradientní eluce s mobilními fázemi 50 mmol/L formiátu amonného a acetonitrilu,
• detekce fluorescencí RF-20A (Ex 330 nm, Em 420 nm, zisk 1).

Hlavní výsledky a diskuse

Ve vzorku bylo detekováno devět hlavních N-glykanů: Man3, G0F-2GN, G0-GN, G0F-GN, G0, Man5, G0F, G1Fa a G1Fb. Chromatografická separace umožnila rozlišení isomerů G1Fa a G1Fb a kvantitativní stanovení jejich relativního zastoupení. Relativní abundancí glykanů byly srovnatelné s dříve publikovanými výsledky AD-0191. Opakovatelnost retenčního času a plochy píků byla lepší než 2 % RSD.

Přínosy a praktické využití metody

Zkrácení přípravy vzorku na méně než tři hodiny významně šetří pracovní čas laboratoře. Zvýšené rozlišení píků zajišťuje přesnější kvantifikaci glykanových profilů, což je klíčové pro kontrolu kvality v biotechnologické výrobě a výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalšími kroky mohou být plná automatizace pomocí robotického systému GlycoAutoPrepTM, integrace s hmotnostní spektrometrií pro strukturu glykanů a rozšíření metody na vysokopropustné glykomické studie. Metoda má potenciál pro charakterizaci různých biosimilars a pro robustní QA/QC procesy.

Závěr

Stanovený workflow kombinuje rychlou a jednoduchou přípravu vzorku s vysoce citlivou fluorescenční UHPLC analýzou. Metoda přináší spolehlivé rozlišení a kvantifikaci N-glykanů na monoklonálních protilátkách s vysokou opakovatelností.