N-glycan Profiling of monoclonal Antibody (mAb) on Nexera Bio UHPLC Coupled with Fluorescence Detector and Q-TOF Mass Spectrometer

Význam tématu

N-linked glykosylace na Asn zbytcích monoklonálních protilátek hraje zásadní roli v jejich stabilitě, biologické účinnosti a imunogenicitě. Precizní a opakovatelná analýza glykánových profilů je nezbytná pro zajištění kvality terapeutických mAbs, zejména u biosimilárních produktů, kde drobné změny v glykosylaci mohou ovlivnit bezpečnost a účinnost léčiva.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo vytvořit a validovat robustní, citlivou a reprodukovatelnou analytickou platformu pro profilování N-glykánů z bevacizumabu biosimiláru. Klíčové kroky zahrnovaly uvolnění glykánů enyzmatem PNGase F, značení 2-aminobenzamidem (2-AB), očistu, chromatografickou separaci, fluorescenční detekci a hmotnostní spektrometrii za účelem kvantifikace a strukturové identifikace.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorku:

• Solubilizace mAb v Tris pufru, odstranění solí membránovou filtrací (10 kDa MWCO).
• Redukce disulfidických vazeb DTT a následná alkylace IAA.
• Deglykosylace inkubací s PNGase F při 37 °C přes noc.
• Extrahování uvolněných glykánů na kartridžích LudgerClean™ EB10.
• Značení 2-AB v přítomnosti acetonitrilu, kyseliny octové a DMSO s NaCNBH₃.
• Odstranění přebytečného značení na LudgerClean™ S cartridge a sušení vzorku.
• Rekonsitituce v 50 % acetonitrilu pro analýzu LC/fluorescence/MS.

Použitá instrumentace

Separační a detekční systém:

• UHPLC: Shimadzu Nexera Bio UHPLC, kolona HALO® Glycan 2.7 µm, 150×2.1 mm, 60 °C, tok 0.4 mL/min.
• Fluorescenční detektor: RF-20A (Ex 330 nm, Em 420 nm, datový tok 1 pt/s).
• MS: Shimadzu LCMS-9030 (Q-TOF) s HESI, rozhraní 4 kV, teplota 300 °C, N₂ a vzduch jako nosný a doplňkový plyn, rozsahy 500–2500 m/z (MS) a 100–2500 m/z (MS/MS), kolizní energie 50±17 V.

Hlavní výsledky a diskuse

Reprodukovatelnost UHPLC/RF (n=3) vykázala RSD <2 % pro plochy i retenční časy všech glykánů. Celkem bylo identifikováno devět 2-AB značených N-glykánů (Man3, G0F-2GN, G0-GN, G0F-GN, G0, Man5, G0F, G1Fa, G1Fb). LCMS-9030 potvrdil strukturální iden­tifikaci s hmotnostní chybou <2 ppm a typické MS/MS fragmentační vzory poskytly vysokou důvěru v určení glykanových struktur. Relativní kvantifikace ukázala, že G0F tvoří až 87,23 % celkového podílu glykánů v bevacizumabu biosimiláru.

Přínosy a praktické využití metody

Tento analytický protokol nabízí robustní a citlivé řešení pro rutinní QC i výzkum biofarmaceutických protilátek. Kombinace UHPLC, fluorescenční detekce a Q-TOF MS umožňuje přesnou kvantifikaci, spolehlivou identifikaci i monitorování stability glykánových vzorců během vývoje a výroby.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj vysoce výkonných separačních technik a pokročilé MS instrumentace (MSn, vysokorozlišující detektory) podporuje detailní studium glykanové struktury a izomerie. Automatizované pracovní postupy, vysokoprůtokové platformy a integrace datové analýzy založené na strojovém učení umožní ještě rychlejší a komplexnější glykomické profily pro nové biologické léčiva.

Závěr

Studie prokázala, že systém Nexera Bio UHPLC spojený s RF-20A a LCMS-9030 Q-TOF MS je vysoce výkonný, reprodukovatelný a citlivý nástroj pro profilování a kvantifikaci N-glykánů v biosimilárních mAb produktech. Výsledky potvrzují jeho vhodnost pro rutinní charakterizaci kvality a strukturálních vlastností glykanových forem.

Reference

1. Ludger Ltd. LudgerClean™ EB10 User Guide. 2. Keser T., Pavić T., Lauc G., Gornik O. Comparison of 2-Aminobenzamide, Procainamide and RapiFluor-MS as Derivatizing Agents for High-Throughput HILIC-UPLC-FLR-MS N-glycan Analysis. Front Chem. 2018;6:324.
3. Ludger Ltd. LudgerClean™ S User Guide.