Rapid Detection and Quantification of Selected Microsomal Substrates and Metabolites Using the Waters ACQUITY UPLC I-Class System and Xevo TQ-S micro

Význam tématu

V raných fázích vývoje léčiv je klíčové rychle a citlivě stanovit metabolické vlastnosti kandidátů a jejich vzájemné interakce s enzymy cytochromu P450. Včasná detekce možného ovlivnění metabolizace snižuje náklady spojené s pozdějšími nečekanými nežádoucími účinky a selháním ve fázi klinického vývoje.

Cíle a přehled studie / článku

Studie byla zaměřena na vývoj a validaci robustní UPLC–MS metody pro simultánní detekci a kvantifikaci osmi vybraných substrátů CYP450 a jejich metabolitů v mikrozomálních inkubátech. Hlavním cílem bylo dosáhnout vysoké propustnosti, citlivosti a shody s FDA požadavky na bioanalytickou validaci.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografická separace pomocí Waters ACQUITY UPLC I-Class s kolonkou BEH C18 (1,7 µm, 3×50 mm). Gradient 1→90 % organické fáze za 2 minuty, průtok 0,6 mL/min, teplota 35 °C, objem injekce 5 µL.
• Detekce na Xevo TQ-S micro (ESI+, MRM, rychlé přepínání polarity). Sledování 16 přechodů s dobou sběru 5 ms a optimalizovanými kolizními energiemi.
• Řízení a zpracování dat v softwaru MassLynx a TargetLynx. Využití RADAR módu pro současné získání full-scan a MRM dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografické píky s šířkou kolem 3 s umožnily rozlišení všech analyzovaných látek při vysoké propustnosti.
• Kalibrační křivky v rozsahu 0,2–500 nM vykázaly lineárnost r2 > 0,99, dolní mez kvantifikace 0,2 nM se S/N > 14.
• Přesnost a preciznost validace podle FDA spadala v rozsah ≤ 15 % CV pro celé testované rozmezí 0,2–5 000 nM.
• Skenovací frekvence umožnila více než 20 bodů na pík, což zajistilo spolehlivé kvantifikování úzkých UPLC píků.
• RADAR akvizice prokázala schopnost detekovat neočekávané komponenty v plném spektru a identifikovat možné vzájemné rušení matice.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený postup kombinuje rychlou analýzu s nízkými LOQ, redukuje počet samostatných testů a výrazně zvyšuje throughput screeningů DDI. Metoda je vhodná pro rutinní ADME testování a screening knihoven sloučenin.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření RADAR módu pro komplexní metabolomické studie, další optimalizace pro zkrácení doby analýzy a automatizace. Metoda lze adaptovat pro další enzymové izoformy i náročnější biologické matrice.

Závěr

Kombinace UPLC I-Class a Xevo TQ-S micro poskytuje rychlou, citlivou a vysoce reprodukovatelnou metodu pro kvantifikaci CYP450 substrátů a metabolitů plně v souladu s FDA bioanalytickými standardy. Výsledný workflow zvyšuje efektivitu screeningů a minimalizuje rizika matrix efektů.

Reference

• Plumb R, Potts W, Rainville P, Alden P, Shave D, Baynham G, Mazzeo J. Addressing the analytical throughput challenges in ADME screening using rapid ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry methodologies. Rapid Commun Mass Spectrom. 2008;22(14):2139–52.
• Adlen P, Plumb R, Jones M, Rainville P, Shave D. A rapid ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometric methodology for the in vitro analysis of pooled and cocktail cytochrome P450 assays. Rapid Commun Mass Spectrom. 2010;24(1):147–54.
• FDA Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation. 2001.