UPLC/MS/MS ANALYSIS OF 9 METABOLITES FOR CYTOCHROME P450 INHIBITION STUDIES IN A SINGLE ANALYTICAL RUN

Význam tématu

CYP450 enzymy hrají zásadní roli v metabolismu léčiv a hodnocení jejich inhibice je klíčové pro předklinické DMPK studie. Rychlá a spolehlivá analýza metabolitů umožňuje efektivně predikovat lékovou interakci a bezpečnost nových kandidátů.

Cíle a přehled studie

Platforma MetaboQuan-R byla navržena jako univerzální UPLC/MS/MS systém pro cílenou analýzu různých tříd sloučenin. Cílem tohoto projektu bylo ověřit schopnost jediné analytické běhu detekovat a kvantifikovat devět klíčových metabolitů používaných v CYP inhibition assay pro isoformy CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 a CYP3A4.

Použitá instrumentace

• LC systém: ACQUITY I-Class FL
• Kolona: CORTECS T3, 2.1 × 30 mm, velikost částic 2.7 µm, teplota 60 °C
• MS systém: Xevo TQ-S Micro

Použitá metodika

Analýza proběhla na generickém chromatografickém režimu: mobilní fáze A (0,01 % kyseliny mravenčí, 0,2 mM amonného formiátu ve vodě), fáze B (0,01 % kyseliny mravenčí, 0,2 mM amonného formiátu v 50/50 acetonitril/isopropanol). Gradient začínal na 10 % B, během 0,8 minuty přešel na 98 % B, poté se vrátil na výchozí podmínky. Metody MRM byly optimalizovány pro každou metabolit-produkt ionovou dvojici.

Hlavní výsledky a diskuse

• Nový chromatografický protokol úspěšně oddělil všech devět metabolitů v jednom běhu vč. izobarických interferencí (např. 6β-hydroxy-testosteron).
• IC50 hodnoty získané z kombinační metody odpovídaly výsledkům samostatných assay u sedmi z devíti metabolitů.
• U metabolitů 6-hydroxypaclitaxel a 4-hydroxy-mephenytoin byla horší reprodukovatelnost, pravděpodobně kvůli míchání kazet vzorků.
• Interference u acetaminofenu mohla vzniknout termickou degradací fenacetinu.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy a snížení spotřeby rozpouštědel díky jediné injekci.
• Univerzálnost platformy umožňuje snadnou výměnu gradientních protokolů bez úprav stacionární fáze.
• Vysoká propustnost vhodná pro screeningové DMPK a toxikologické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace přípravy vzorků a kazetování pro zvýšení reproducibility u citlivých sloučenin.
• Rozšíření panelu analýz o další metabolity a konjugáty pro komplexnější hodnocení účinku na CYP450.
• Integrace s automatizovanými robotickými systémy pro vysokopropustné screeningové workflow.

Závěr

MetaboQuan-R platforma prokázala schopnost analyzovat devět klíčových CYP450 metabolitů v jednom běhu srovnatelně přesně jako tradiční oddělené metody. Metoda slibuje efektivní řešení pro DMPK screening a další biomedicínské aplikace.

Reference

• Waters Corporation. Targeted Omics. www.waters.com/targetedomics