APPLICATION NOTEBOOK - TARGETED METABOLOMICS AND LIPIDOMICS

Význam tématu

Metabolomika a lipidomika na bázi cílené analýzy pomocí moderních LC/MS a SFC/MS metod umožňují rychlé, citlivé a reprodukovatelné stanovení širokého spektra endogenních metabolitů a lipidů v komplexních biologických maticích. Tyto přístupy slouží k podpoře výzkumu biomarkerů, pochopení biochemických drah v základním výzkumu, klinických studiích, QA/QC i farmaceutickém vývoji.

Cíle a přehled studie / článku

Publikace shrnuje řadu aplikačních přístupů: absolutní kvantifikaci aminokyselin v moči pomocí UPLC–MS/MS; cílenou metabolomiku s AbsoluteIDQ p180 kitem; cílenou lipidomiku oxylipinů; metabolické signatury pro progresi nádorových buněk; definitivní lipidomiku plazmy; simultánní analýzu katecholaminů a metanefrinů; profilování žlučových kyselin; cílenou metabolomiku pomocí ionKey/MS; multiplexní stanovení steroidních hormonů; analýzu volných mastných kyselin UPC²/MS; steroidní metabolomiku UPC²–MS; a enantiomerické/diastereomerické separace vůňových sloučenin na UPC² Trefoil kolonách.

Použitá metodika a instrumentace

• ULTRA PERFORMANCE LC systémy ACQUITY UPLC a UPC² s různými analytickými kolonkami (BEH, BEH HILIC, CSH, Amide, Trefoil AMY1/CEL1).
• Hmotové spektrometry Xevo TQ, Xevo TQ-S, QTof Premier, SYNAPT G2 HDMS v režimech MRM, MS^E a ion mobility.
• Specifické přípravné postupy: EPA SPE, Ostro sample prep, kits pro metabolomy/lipidomy, denaturace, derivatizace AccQ•Tag.
• Konvergence chromatografie (UPC²) s CO₂ a modifikátory, tunelované mikrokapiláry ionKey a nanoflow.
• Softwarové nástroje: MassLynx, TargetLynx, MarkerLynx XS, UNIFI, TransOmics, Empower.

Hlavní výsledky a diskuse

• Aminokyseliny: absolutně kvantifikováno 20 proteinogenních aminokyselin a dalších relativně v 7,5min metodě, LLOQ 0,2 µM, vysoká přesnost a selektivita.
• Cílená metabolomika p180 kitem: simultánní kvantifikace >180 metabolitů z šesti tříd v séru myší po radiačním ozařování; identifikace biomarkerů expozice.
• Oxylipiny: UPC²–ESI MS/MS profiling >100 bioaktivních oxidovaných MK v plazmě; separace isomerů a nízké matrice efekty SPE + HSS C18).
• Metabolické signatury buněk: cílená i globální metabolomika (SYNAPT G2 MS^E) odhaluje změny glykolýzy a TCA cyklu v agresivních buňkách.
• Lipidomika plazmy: off-line obohacení phospholipidů (Oasis SPE) + HILIC UPLC–MS/MS, 215 MRM lipidů, 10 tříd lipidů, 96-well vysoká propustnost.
• Katecholaminy/metanefriny: WCX µElution Plet + HILIC UPLC–MS/MS (Amide kolona), korektní LLOQ 0,2–1,9 pg/mL, matrifové efekty <10 %.
• Žlučové kyseliny: UPLC QTof MS^E rozliší jemné konjugáty (glycin, taurine) a profiluje >30 žlučových kyselin v 5 min.
• ionKey/MS lipidomika: mikroflow 2 µL/min, nástřik 0,2 µL, citlivost 10-400× vyšší vs 2,1 mm I.D.; separuje >200 lipidů v rámci 10-min runu.
• Steroidi: multiplexní LC–MS/MS TQ-S s ionKey, 100–400× citlivější, 150× méně spotřeby sol‐ ventu, LLOQ <1 ng/mL pro testosteron, kortisol aj.
• Volné MK UPC²/MS: extrakt isopropanolem, 3min gradient, detekce bez derivatizace, separace C8–C36, je trno- a cis/trans izomerů.
• Žlučové kyseliny UPC²/MS: 25 žk + konjugáty glycin/taurin profily v 13min, aplikace v myším séru pro biomarkery hepatotoxicity.
• Stery UPC²–MS: 9 steroidů separo‐ vano během 2min gradientu, MRM TQ-S, linearita do 500 ng/mL, RSD <14 %.
• Enantiomery vůní UPC² Trefoil: separace carvonu, linaloolu, terpinen-4-olu a nerolidolu za 2–3 min s vysokým rozlišením enantiomerů a diastereomerů.

Přínosy a praktické využití metody

Moderní UPLC–MS a UPC²–MS přístupy poskytují: zkrácené run time až 10×, zvýšenou citlivost až 400×, vyšší propustnost (>100 vzorků/den), nižší spotřebu organických rozpouštědel, eliminaci složité derivatizace a standardizaci assay pro rutinní analýzu biomarkerů, klinický výzkum i průmyslovou analytiku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další miniaturizace (nanoLC), rozšíření ionKey/microflow pro multikilomolekulární profiling, spojení ion mobility-MS pro lepší izomerní separace, plná automatizace od přípravy až po chemometrickou analýzu (Toimics, UNIFI), a integrace s bioinformatikou budou utvářet další rozvoj high‐throughput metabolomiky a lipidomiky.

Závěr

Prezentované workflow dokládají flexibilitu a robustnost moderních chromatograficko‐ hmotnostních metod (UPLC–MS a UPC²–MS) pro cílenou i globální analýzu metabolitů, lipidů, steroidů, MK, oksylipinů a dalších důležitých biomolekul. Tyto přístupy výrazně zrychlují objevování a validaci biomarkerů, podporují vývoj léčiv a umožňují rutinní klinické aplikace.

Reference

• Houten SM et al. Endocrine functions of bile acids. EMBO J. 2006;25(7):1419–25.
• Qiao X et al. Bile acid metabonomics by LC–MS/MS. Steroids. 2012;77(7):745–55.
• Wishart DS et al. HMDB: the human metabolome database. Nucleic Acids Res. 2007;35:D521–6.
• Kuhn E et al. MetaboAnalyst 2.0. Nucl Acids Res. 2012;40:W127–33.
• Hart SL et al. CC profiling free fatty acids. Bioanalysis. 2012;4(7):783–94.
• Leffingwell J, Leffingwell D. Chiral chemistry in flavours and fragrances. Spec Chem. 2010;30–33.