Optimizing Peak Capacity in Nanoscale Trap-Elute Peptide Separations with Differential Column Heating

Význam tématu

Maximalizace kapacity špiček v nanoskopických trap-elute peptidech separacích je klíčová pro spolehlivou detekci nízkoabundantních biomolekul v proteomických a klinických aplikacích. Nízké průtoky nanoskopické LC zvyšují citlivost hmotnostní spektrometrie, avšak vyžadují optimalizované podmínky záchytu a následného refokusu peptidů, aby bylo dosaženo vysokého rozlišení a dynamického rozsahu.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřuje na vývoj vysoce kapacitních trap-elute nanoskopických separací peptidů s využitím diferenciálního ohřevu pastičky (trap column) a analytické kolony. Cílem bylo:

• Porovnat retentivitu běžných C18 fází (Symmetry C18, CSH C18, BEH C18, HSS T3).
• Demonstrovat vliv nezávislého nastavení teploty pastičky a analytické kolony na kapacitu špiček.
• Optimalizovat jednopumpové i dvoupumpové „reverse flush“ uspořádání pro dosažení kapacity blízké přímé injekci.
• Ověřit vysokou zatížitelnost metody pro analýzu nízkoabundantních peptidů, včetně fosfopeptidů.

Použitá metodika a instrumentace

Experimenty byly provedeny na systému ACQUITY UPLC M-Class vybaveném:

• ACQUITY Column Heater (CH-A) pro nezávislé topení trap a analytické kolony.
• Trapping kolona: Symmetry C18, 5 µm, 180 µm × 20 mm.
• Analytická kolona: ACQUITY UPLC M-Class CSH C18, 1.7 µm, 75 µm × 150 mm.
• MS detekce: SYNAPT G2-S nebo Xevo G2 QTof s ESI+ a MassLynx Software v4.1.
• Konfigurace: přímá injekce, jednopumpové forward-elute trapping a dvoupumpové reverse-flush trapping.
• Teploty: trap 30–60 °C, analytická 30–60 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Retentivita fází byla seřazena: Symmetry C18 < CSH C18 < BEH C18 < HSS T3. Zvýšení teploty o 30 °C snížilo retentivitu pastičky o několik procent acetonitrilu, což umožnilo lepší refokus na analytické kolony.

Jednopumpové uspořádání přineslo nárůst kapacity špiček z 322 (trap 30 °C, analytická 30 °C) na 495 (trap 60 °C, analytická 30 °C), což odpovídá 77 % kapacity přímé injekce (643).

U dvoupumpového reverse-flush uspořádání se při trap 60 °C a analytické koloni 30–40 °C dosáhlo kapacity špiček v rozmezí 580–600, tj. na 90–95 % přímé injekce.

Vysoké zatížení až 10 pmol enolase tryptického digestu s fosfopeptidy zachovalo kapacitu 530 (jen 6 % pokles oproti 1 pmol), přičemž molekula VNQIGTLpSEpSIK byla detekována se signál-šum >100.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Rychlé online zachycení velkých objemů vzorku a desalting bez dodatečných spojů.
• Dosažení vysoké kapacity špiček i při vysokém zatížení díky CSH C18 fázi.
• Citlivou detekci nízkoabundantních a post-translačně modifikovaných peptidů.
• Rozšíření dynamického rozsahu proteomických analýz.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat integraci adaptivního řízení gradientu a teploty, kombinaci s iontovým párováním v trapu, automatizované mapování proteomů v klinických studiích a cílené analýzy biomarkerů v mikroprůtokových systémech.

Závěr

Diferenciální ohřev pastičky a analytické kolony v kombinaci s reverse-flush trappingem umožňuje téměř plnou kapacitu špiček přímé injekce. Použití CSH C18 v analytické koloně poskytuje vynikající zatížitelnost a rozlišení, což zvyšuje citlivost nanoskopických LC-MS peptidech separací.

Reference

1. Vissers J.P. Recent developments in microcolumn liquid chromatography. J Chromatogr A. 1999;856(1-2):117–143.
2. Meiring H.D. et al. Nanoscale LC-MS(n): technical design and applications to peptide and protein analysis. J Sep Sci. 2002;25:557–568.
3. Paweletz C.P. et al. Identification of direct target engagement biomarkers for kinase-targeted therapeutics. PLoS One. 2011;6(10):e26459.
4. Andersen J.N. et al. Pathway-based identification of biomarkers for targeted therapeutics: personalized oncology with PI3K pathway inhibitors. Sci Transl Med. 2010;2(43):43ra55.
5. Lauber M.A. et al. High-Resolution Peptide Mapping Separations with MS-Friendly Mobile Phases and Charge-Surface-Modified C18. Anal Chem. 2013;85(14):6936–6944.
6. Lauber M.A. et al. Increasing Peak Capacity in Reversed Phase Separations of Peptides with Charged Surface Hybrid C18 Columns. Waters Application Note. 2013.
7. Lauber M.A. et al. Charged Surface Hybrid C18 for High Peak Capacity nanoLC Peptide Separations. Waters Application Note. 2013.
8. Lauber M.A. et al. Peptide Mapping and Small Protein Separations with Charged Surface Hybrid C18 and TFA-Free Mobile Phases. Waters Application Note. 2013.
9. Gritti F., Guiochon G. Adsorption behaviors of neutral and ionizable compounds on hybrid stationary phases. J Chromatogr A. 2013;1282:58–71.
10. Brownridge P.J. et al. Absolute Quantification of Yeast Kinases by LC/MS/MS using QconCAT and MRM Technologies. Waters Application Note. 2014.
11. Schenauer M.R. et al. Identification and quantification of host cell protein impurities in biotherapeutics using mass spectrometry. Anal Biochem. 2012;428(2):150–157.
12. Schenauer M.R. et al. Profiling the effects of process changes on residual host cell proteins in biotherapeutics by mass spectrometry. Biotechnol Prog. 2013;29(4):951–957.
13. Gao X. et al. A reversed-phase capillary UPLC-MS method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 2012;402(9):2923–2933.
14. Pizzatti L. et al. Label-free MSE proteomic analysis of chronic myeloid leukemia bone marrow plasma. Proteomics. 2012;12(17):2618–2626.
15. Waters Corporation. MassPREP Enolase Digest with Phosphopeptides Mix. Care and Use Manual. 2008.