Evaluating 2D-RP/RP Fractionation Capabilities of the ACQUITY UPLC M-Class System with 300-μm I.D. Configuration

Význam tématu

Ve výrobě a kontrole bioterapeutik je kritické detekovat a kvantifikovat nízkokoncentrované hostitelské proteiny (HCPs) na úrovni jednotek až stovek ppm. Tradiční jednorozměrné chromatografické metody často nedosahují potřebného rozlišení a dynamického rozsahu. Orthogonální 2D RP/RP fractionation přístupy přinášejí výrazné rozšíření dynamického rozsahu a zlepšení selektivity.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ověřit chromatografické schopnosti systému ACQUITY UPLC M-Class s 2D technologii (300 µm I.D.) při pěti-krokové RP/RP fractionaci dvou peptidových směsí: MassPREP Digestion Standard MIX-1 a ENL Digestion Standard. Autoři testovali, zda tento mikrosystém nabídne dostatečné rozlišení, reprodukovatelnost a schopnost detekovat nízké úrovně analyzovaných peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

• První dimenze: XBridge Peptide BEH C18 (1.0×50 mm, 5 µm, 300 Å) při pH 10 s krokovým gradientem (ACN 11,4 % → 50 %).
• Trap kolona: Symmetry C18 2D HCP Trap (300 µm×25 mm, 5 µm) pro zachycení frakcí.
• Druhá dimenze: HSS T3 (300 µm×150 mm, 1,8 µm, 100 Å) při pH 2,5 pro high-resolution separaci.
• MS detekce: SYNAPT G2-S HDMS (nebo Xevo G2-XS) v režimu MS^E, ESI+, m/z 100–1990, kapilární napětí 2,6 kV, desolvační teplota 150 °C.
• Software pro řízení a zpracování dat: MassLynx v4.1.

Hlavní výsledky a diskuse

V pěti-krokové fractionaci směsi MIX-1 bylo identifikováno 11 klíčových peptidů, ve frakcích elujících při 11,4 %, 14,7 %, 17,4 %, 20,7 % a 50 % ACN. U vzorku ENL bylo detekováno 12 peptidů. Na základě šířky píků ve druhé dimenzi byla vypočtena průměrná kapacita kolony ~200 píků, což při pěti frakcích odpovídá teoretické dvoudimenziální kapacitě ~1000 píků. Výsledky potvrzují vysokou selektivitu a reprodukovatelnost systému.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace mikroscale 2D RP/RP separace přináší:

• Rozšířený dynamický rozsah pro detekci nízkých HCP.
• Vyšší vrstvu orthogonality mezi pH 10 a pH 2,5.
• Možnost automatiké online fractionace a přímé MS**E** detekce.
• Zvýšenou citlivost a robustnost pro QA/QC laboratoře v biotechnologickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj očekáváme v oblasti dále miniaturizovaných 2D rozhraní, integrace s vyšším paralelismem frakcí a vylepšeném softwarovém zpracování dat. Technologie může nalézt uplatnění nejen v analýze HCP, ale i v proteomice, metabolomice a v oblasti monitoringu posttranslačních modifikací.

Závěr

Studie prokázala, že ACQUITY UPLC M-Class System s 2D Technology (300 µm I.D.) poskytuje vysoké chromatografické rozlišení a teoretickou kapacitu až 1000 píků v dvourozměrné RP/RP fractionaci. Konfigurace je vhodná pro kvantitativní analýzu nízkokoncentrovaných peptidů a HCP ve vysoce čistých bioterapeutikách.

Reference

1. Doneanu C. et al. mAbs. 2012;4(1):24–44.
2. Schenauer M.R. et al. Anal Biochem. 2012;428(2):150–157.
3. Labrou N.E. (ed.) Protein Downstream Processing, Methods in Molecular Biology 1129. 2014.
4. Zhang Q. et al. mAbs. 2014;6(3):659–670.
5. Thomson J.H. et al. Rapid Commun Mass Spec. 2014;28(8):855–860.
6. Gilar M. et al. Anal Chem. 2005;77(19):6426–6434.