The Analysis of Allergens in Raw and Roasted Peanuts Using nanoACQUITY UPLC and Xevo Q-Tof MS

Význam tématu

Rostoucí výskyt potravinových alergií vyžaduje citlivé a specifické analytické metody pro detekci alergenů v potravinových výrobcích. Proteomické přístupy založené na kapalinové chromatografii spojené s hmotnostní spektrometrií (LC–MS) umožňují současnou identifikaci a kvantifikaci alergenů v jejich původní i modifikované formě, což je nezbytné pro kontrolu dodržování potravinářských předpisů a zajištění bezpečnosti alergiků.

Cíle a přehled studie

Studie hodnotí využití systému nanoACQUITY UPLC spojeného s hmotnostním spektrometrem Xevo QTof a softwarem ProteinLynx Global SERVER (PLGS) pro charakterizaci, identifikaci a kvantifikaci peptidových markerů allergenu Ara h1 v syrových a pražených arašídech. Cílem bylo ověřit reprodukovatelnost, pokrytí sledovaného proteinu a stanovitelnost markerů v potravinovém matrice.

Použitá metodika

Výzkum využívá bottom-up proteomiku následujícím způsobem:

• Extrahování proteinu Ara h1 z raw a pražených arašídů pomocí tlumivého roztoku a srážky amonným síranem.
• Denaturace a tryptická štěpení s přidaným surfaktantem RapiGest SF, následná redukce DTT a alkylace IAA.
• Přídavek alkohol dehydrogenázy (ADH) jako vnitřního standardu pro absolutní kvantifikaci.
• Separace peptidů na nanoACQUITY UPLC s gradientem kyseliny formylové v acetonitrilu/vodě.
• Data-independent MSE akvizice s dvěma úrovněmi kolizní energie na Xevo QTof MS.
• Vyhodnocení dat databázovým vyhledáváním ve SwissProt pomocí PLGS se zohledněním fixních a variabilních modifikací včetně glykosylace.

Použitá instrumentace

• nanoACQUITY UPLC System s kolonkou BEH C18 (75 µm x 150 mm, 35 °C)
• Xevo QTof MS s ESI ionizací v pozitivním režimu
• ProteinLynx Global SERVER pro zpracování MSE dat a kvantifikaci

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza ukázala vysoko reprodukovatelnou chromatografii i hmotnostní spektrometrii s průměrným pokrytím sekvence Ara h1 kolem 60 % (49–55 peptidů). Byly identifikovány klíčové peptidy NNPFYFPSR, DLAFPGSGEQVEK a VLLEENAGGEQEER jako spolehlivé markery přítomné v obou typech vzorků. Kvantifikace v potravinové matrici dosáhla detekce až 10 fmol Ara h1 s 26% pokrytím a 12 peptidy.

Přínosy a praktické využití

Metoda kombinuje vysokou selektivitu exaktní hmotnosti a fragmentačních dat MSE pro minimální pravděpodobnost falešných pozitiv. Umožňuje bezštítnou kvantifikaci alergenů v komplexních potravinových matricích a je vhodná pro kontrolu průmyslové výroby a označování produktů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření průzkumu dalších potravinových alergenů v multiplexním režimu, zlepšení algoritmů pro charakterizaci neznámých modifikací, zvýšení průchodnosti analýz a integrace s imunoanalytickými technikami pro komplexní monitoring potravinové bezpečnosti.

Závěr

Popsaný pracovní postup nanoACQUITY UPLC–Xevo QTof MS–PLGS prokazuje vysokou citlivost, selektivitu a spolehlivost při detekci a kvantifikaci Ara h1 v syrových i pražených arašídech a v potravinové matrici. Metoda nabízí komplexní řešení pro potravinovou analytiku z hlediska regulací a ochrany alergiků.

Reference

1. Maleki SJ, Kopper RA, Shin DS, Stanley SJ, Sampson H, Burks AW, Bannon GA. Structure of the Major Peanut Allergen Ara h1 May Protect IgE-Binding Epitopes from Degradation. J Immunol. 2000;164:5844–5849.
2. Tariq SM, Stevens M, Matthews SM, Ridout S, Twiselton R, Hide DW. Food Allergy Epidemiology in the UK. Br Med J. 1996;313:514–517.
3. Hourihane JO, Kilburn SA, Nordlee JA, Hefle SL, Taylor SL, Warner JO. Trends in Food Allergy Prevalence. J Allergy Clin Immunol. 2007;119:1197–1202.
4. van Hengel AJ, Anklam E, Taylor SL, Hefle SL. Analysis of Food Allergens and Practical Application. Food Toxicant Analysis. 2006;Elsevier:189–229.
5. Careri M, Costa A, Elviri L, Lagos J, Mangia A, Terenghi M, Cereti A, Perono Garoffo L. LC–MS Analysis of Peanut Allergens. Anal Bioanal Chem. 2007;389:1901–1907.
6. Monaci L, van Hengel AJ. Detection of Food Allergens by LC–MS. J Chrom A. 2008;1192:113–120.
7. Kirsch S, Fourdrilis S, Dobson R, Scippo ML, Maghuin-Rogister G, De Pauw E. QTof MS for Allergen Analysis. Anal Bioanal Chem. 2009;395:57–67.
8. Ferranti P. Quantification of Allergens by Mass Spectrometry. Eur J Mass Spectrom. 2004;10:349–358.
9. Silva JC, Gorenstein MV, Li GZ, Vissers JPC, Geromanos SJ. Absolute Quantification with MSE. Mol Cell Proteomics. 2006;5:144–156.
10. Waters Corporation. nanoACQUITY UPLC and Xevo QTof MS Application Note. 2010.