Size Exclusion Chromatography/ Mass Spectrometry Analysis of Antibody Drug Conjugates Using the Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert LC

Význam tématu

Monoklonální protilátky konjugované s cytotoxickými molekulami (ADC) představují vysoce cílenou formu léčby onkologických onemocnění. Díky specifickému navázání na antigeny na povrchu nádorových buněk může ADC minimalizovat toxicitu vůči zdravé tkáni a zároveň zlepšit farmakokinetiku léčiva.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo demonstrovat použití SEC/MS analýzy pro charakterizaci rekombinantní protilátky Trastuzumabu a jejího ADC konjugátu Trastuzumab emtansinu (T-DM1). Studie využívá Agilent 1260 Infinity II Bio-inert LC spojený s Q-TOF hmotnostním spektrometrem k rychlé a reprodukovatelné analýze a stanovení průměrného poměru nálož–protilátka (DAR).

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byla zvolena velikostně vylučovací chromatografie (SEC) s mobilní fází 50 % acetonitril, 49 % voda, 1 % kyselina mravenčí, průtokem 0,5 mL/min a teplotou kolony 30 °C. Klíčové moduly LC byly:

• Agilent 1260 Infinity II Bio-inert Pump (G5654A)
• Agilent 1260 Infinity II Bio-inert Multisampler (G5668A)
• Agilent 1260 Infinity II Multi Column Thermostat s bio-inert heat exchanger (G7116A, Option #019)
• Agilent 1260 Infinity II Diode Array Detector WR s bio-inert flow cell (G7115A, Option #028)
• Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS

Vzorky (1 mg/mL) byly před analýzou od-glykozylovány N-glykanázou při 37 °C přes noc. SEC kolona Agilent Bio SEC-3 (300 Å, 7,8×300 mm, 3 μm) byla před analýzou propláchnuta 48 hodin mobilní fází.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vysokou reprodukovatelnost (RSD retenční doby 0,012 %, RSD plochy 0,486 %). De-konvoluce hmotnostních spekter odhalila u intactního Trastuzumabu heterogenní glykoformy, pro od-glykozylovaný vzorek se získal jediný hlavní signál (145 173 Da). U T-DM1 vedla od-glykozylace k jasnému rozlišení devíti šestištěpých šarží (D0–D8) s intervalem 958 Da, odpovídajícím hmotnosti jedné DM1 molekuly s linkerem. Pomocí softwaru Agilent DAR Calculator byl spočítán průměrný DAR 3,1, v souladu s literárními údaji.

Přínosy a praktické využití metody

Size exclusion chromatography v kombinaci s online Q-TOF MS umožňuje:

• Rychlé odsolení a minimalizaci aduktů solí
• Jednoduchou optimalizaci metody bez vysokých teplot či organických pufrů
• Spolehlivé stanovení DAR u lysinově konjugovaných ADC
• Charakterizaci glykoformních variant mAb

Budoucí trendy a možnosti využití

S rozvojem high-resolution MS a pokročilých softwarových nástrojů lze očekávat:

• Automatizaci vyhodnocení DAR a glykoformních profilů
• Rozšíření SEC/MS pro multikomponentní biologika a bispecifické protilátky
• Integraci s dalšími separačními technikami (např. HIC, RP-LC) pro komplexní analýzu ADC

Závěr

Agilent 1260 Infinity II Bio-inert LC spojený s Q-TOF MS poskytuje robustní a citlivý přístup k analýze intactních protilátek i jejich ADC konjugátů. SEC/MS workflow minimalizuje potřebu složitých úprav metody, zajišťuje vysokou reprodukovatelnost a umožňuje přesné stanovení průměrného DAR.

Reference

1. Sandra K.; Vandenheede I.; Sandra P. J. Chromatogr. A 2014, 1335, 81–103.
2. McCombs J.R.; Owen S.C. J. Am. Assoc. Pharm. Sci. 2015, 17(2), 339–351.
3. Firer A.; Gellerman G. J. Hematol. Oncol. 2012, 5, 70.
4. Rohrer T. Chemistry Today 2009, 27(5), 56–60.
5. Koen S. et al. J. Chromatogr. B 2016.
6. Panowski S. mAbs 2014, 6(1), 34–45.
7. Krop I. et al. ASCO 2010, 28(16), 2689–2704.
8. Wakankar A. et al. mAbs 2011, 3(2), 161–172.
9. Marcoux J. Protein Sci. 2015, 24, 1210–1223.
10. Lazar A.C. et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005, 19, 1806–1814.
11. Chen J.; Murphy S. Agilent 5991-6263EN, 2015.
12. Kim M.T. et al. Bioconjugate Chem. 2014, 25, 1223–1232.