Analysis of Antibody-Drug Conjugates Using Size Exclusion Chromatography and Mass Spectrometry

Význam tématu

Antibody-Drug Conjugates (ADCs) představují moderní třídu biologických léčiv, která kombinují cílěné monoklonální protilátky (mAbs) s vysoce účinnými cytotoxickými látkami. ADCs umožňují přesnější doručení léčiva do nádorových buněk, čímž minimalizují systemickou toxicitu a zlepšují terapeutický index. Analytická kontrola čistoty, agregace, glykozylace a zejména poměru léčiva k protilátce (DAR) je klíčová pro zajištění kvality a účinnosti těchto komplexních molekul.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je demonstrovat robustní analytickou metodu založenou na kombinaci size exclusion chromatography (SEC) a hmotnostní spektrometrie (MS) pro charakterizaci trastuzumabu a jeho konjugátu s DM1 (trastuzumab emtansine, T-DM1). Práce popisuje optimalizaci MS-přátelského pufru, přípravu vzorku včetně deglykozylace a výpočet DAR pomocí Agilent 1290 Infinity II LC a Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF.

Použitá metodika a instrumentace

• Deglykozylace: Inkubace vzorku (1 mg/ml) s N-glykanázou při 37 °C přes noc.
• Chromatografie: SEC na sloupci Agilent Bio SEC-3 (300 Å, 7,8×300 mm, 3 μm) při 0,8 ml/min, 30 °C.
• Mobilní fáze: 50 % acetonitril, 49 % voda, 1 % kyselina mravenčí pro kompatibilitu s MS.
• MS detekce: Agilent 6530 Q-TOF se zdrojem pozitivních iontů, m/z rozsah 100–7000, použití softwaru MassHunter BioConfirm a DAR Calculator.

Hlavní výsledky a diskuse

SEC-MS analýza intactního trastuzumabu odhalila heterogenitu glykoform, kterou bylo možno dekonvolucí rozdělit na jednotlivé varianty kolem základní hmotnosti ~145 kDa. Po deglykozylaci se spektrum značně zjednodušilo. U T-DM1 byly po deglykozylaci identifikovány osmidílné série s přírůstky ~959,7 Da (DM1 + linker), odpovídající druhům D0–D7. Průměrný DAR vypočítaný na ~3,2 odpovídá literárním datům. Srovnání pufru PBS versus ACN/voda/FA ukázalo, že MS-přátelský pufr umožňuje kvalitní ionizaci bez výrazné ztráty špičkového tvaru.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimalizace aduktů soli díky SEC jako odsoušecí kroku.
• Rychlá a snadná kvantifikace DAR z dekonvoluovaných hmotnostních spekter.
• Metoda vyžaduje minimální optimalizaci a je přenositelná na různé ADCs.
• Možnost analýzy velkých proteinových komplexů při pokojové teplotě bez vysokých teplot RP-LC.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozvoj nativní MS a iontové mobility pro detailní charakterizaci konformací ADCs.
• Automatizace on-line deglykozylace a dalších přípravných kroků v LC-MS sekvenci.
• Integrace vysokokapacitních soustav a ultrarychlých SEC metod pro screening stability a agregace.
• Nasazení pokročilých algoritmů pro zpracování dat a přesnější výpočet heterogenity nábojů.

Závěr

Kombinace SEC a MS s použitím MS-kompatibilního pufru poskytuje spolehlivý přístup k charakterizaci mAbs a jejich ADC derivátů. Deglykozylace zjednodušuje spektra a umožňuje přesný výpočet DAR, což je klíčové pro vývoj a kontrolu kvality terapeutických ADCs.

Reference

1. Rohrer T. Antibody drug conjugates: Potent weapons for the oncology arsenal. Chemistry Today 2009;27(5):56–60.
2. Panowski S. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. mAbs 2014;6(1):34–45.
3. Krop I. et al. Phase I Study of Trastuzumab-DM1, an HER2 Antibody-Drug Conjugate, in HER2-Positive Metastatic Breast Cancer. J Clin Oncol 2010;28(16):2689–2704.
4. Wakankar A. et al. Analytical methods for physicochemical characterization of antibody drug conjugates. mAbs 2011;3(2):161–172.
5. Marcoux J. Native mass spectrometry and ion mobility characterization of trastuzumab emtansine. Protein Science 2015;24:1210–1223.
6. Lazar AC. et al. Analysis of the composition of immunoconjugates using size-exclusion chromatography coupled to mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 2005;19:1806–1814.
7. Kim MT. et al. Statistical modeling of the drug load distribution on trastuzumab emtansine (Kadcyla). Bioconjug Chem 2014;25:1223–1232.