A Comprehensive Workflow to Optimize and Execute Protein Aggregate Studies

Význam tématu

Analýza agregací proteinů, zejména monoclonálních protilátek, je kritická pro vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik. Nesprávně charakterizované nebo nekvantifikované agregáty mohou ovlivnit bezpečnost, účinnost a stabilitu léčivých proteinů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vytvořit komplexní workflow pro optimalizaci SEC metodiky a analýzu agregací protilátek. Hlavními kroky byly automatizované míchání různých pufrů, screening 12 mobilních fází v širokém pH rozmezí a kvantifikace monomerů, dimerů a vyšších agregátů za využití UV a světlocítící detekce.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity II Bio-inert LC System
• Bio-inert Quaternary Pump G5654A
• Bio-inert Multisampler s chlazením G5668A
• Multicolumn Thermostat G7116A
• Diode Array Detector WR G7115A (220 nm, 280 nm)
• Bio-SEC Multi Detector System G7805AA (LS 90° a DLS)
• AdvanceBio SEC 300 Å kolony (150×7,8 mm a 300×7,8 mm)

Použitá metodika

Testovány byly tři základní mobilní fáze:

• 150 mM fosfátový pufr (pH 6,2 – 7,4)
• 10 mM fosfát + 140 mM NaCl (PBS-like, pH 6,2 – 7,4)
• 100 mM fosfát + 150 mM NaCl (pH 6,2 – 7,4)

Automatizované složení mobilní fáze podle systému A–D v reálném čase zajišťovalo Agilent Buffer Advisor. Analýze byly podrobeny vzorky rituximabu (originál a biosimilární) a BSA standard. Parametry: kolona 15 cm, průtok 0,8 mL/min, teplota 25 °C, objem injekce 1–25 µL, detekce UV 220 a 280 nm, LS 90° a DLS.

Hlavní výsledky a diskuse

10 mM fosfát + 140 mM NaCl vykazoval výrazné zhoršení tvaru píků a zvýšené protahování. Optimální podmínky se ukázaly při pH 7,0 s 150 mM fosfátovým pufrem nebo 100 mM fosfát + 150 mM NaCl:

• Nejlepší rozlišení monomeru a agregátů a nejkonzistentnější kvantifikace.
• Monomerní molekulová hmotnost ~147 kDa pro originál i biosimilární rituximab, biosimilár měl mírně vyšší hmotnost kvůli variaci C-terminálních lyzinů.
• Světlocíticí detekce odhalila vyšší řády agregátů a jejich relativní množství.
• DLS přidala informaci o hydrodynamickém poloměru (~5,1 nm pro biosimilární monomer).

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a automatizovaná optimalizace mobilních fází bez manuální přípravy desítek roztoků.
• Integrovaná sada detektorů UV, LS a DLS pro komplexní charakterizaci agregátů v jednom běhu.
• Snížení doby analýzy na méně než 10 minut na vzorek při krátkém 15 cm sloupci.
• Možnost přechodu na delší kolony pro vyšší rozlišení při požadavku.
• Robustní nástroj pro QA/QC a výzkumné laboratoře v biotechnologickém i farmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozvoj multi-dimenzionálních SEC metod s paralelním screeningem pH a složení pufrů, integrace s hmotnostní spektrometrií pro detailní proteomické analýzy a nasazení AI-říděného návrhu metodiky. Dalším směrem je zefektivnění datové analýzy a automatizované reportování kritických parametrů agregace.

Závěr

Komplexní workflow vycházející z Agilent 1260 Infinity II Bio-inert LC, Buffer Advisor a Bio-MDS multidetekční sady výrazně urychluje vývoj SEC metodiky a zvyšuje přesnost stanovení proteinových agregátů. Systém umožňuje rychlý přechod od screeningových podmínek k aplikacím s vysokým rozlišením a podporuje spolehlivou kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

• US Department of Health and Human Services, FDA. Guidance for Industry Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products. CDER/CBER, 2014.
• Mahler H-C, et al. Protein Aggregation: Pathways, Induction Factors and Analysis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2008, 98(9).
• Schneider S. 2D-LC/MS Characterization of Charge Variants Using Ion Exchange and Reversed-Phase Chromatography. Agilent Technologies Application Note 5991-6673EN, 2016.