Analysis of Tryptic Digests of a Monoclonal Antibody and an Antibody-Drug Conjugate with the Agilent 1290 Infinity II LC

Význam tématu

Peptidová mapování monoklonálních protilátek (mAb) a protilátkových lékových konjugátů (ADC) je zásadní pro detailní charakterizaci struktury, kontaminantů a posttranslačních modifikací biotherapeutik. Přesná separace peptidů v komplexních digestech zajišťuje spolehlivé kvantitativní a kvalitativní informace potřebné pro vývoj a kontrolu kvality lékových forem.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo demonstrovat schopnost systémů Agilent 1290 Infinity II LC ve spojení s AdvanceBio Peptide Map kolony a různými Jet Weaver mixery optimalizovat separaci tryptických digestů trastuzumabu (Herceptin) a ado-trastuzumabu emtansinu (Kadcyla). Studie zkoumá dopad proměnného gradientu, objemu míchání pohyblivé fáze a výběru mixeru na kapacitu kolony, šum signálu a detekci nízkoabundantních peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II High Speed Pump (G7120A)
• Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)
• Agilent 1290 Infinity II Multicolumn Thermostat (G7116B)
• Agilent 1290 Infinity II Diode Array Detector (G7117B) s 10 mm flow cell
• Agilent AdvanceBio Peptide Map columna, 2.1 × 250 mm, 2.7 µm
• Agilent V380 High-Performance Jet Weaver mixer (380 µL)

Vzorky (100 µg proteinu) byly redukovány DTT, alkylovány iodoacetamidem a digesce probíhala v poměru trypsin:substrát 1:25 po dobu 16 h při 37 °C. Metoda využívala gradient od 0 do 60 % organické fáze s 0,045 % TFA při 0,35 mL/min, detekce na 214 nm (u ADC také 252 nm).

Hlavní výsledky a diskuse

• Zavedení V380 mixeru snížilo UV-šum způsobený TFA téměř na nulovou úroveň, což umožnilo spolehlivou detekci nízkoabundantních peptidů.
• Regulací délky gradientu lze dosáhnout kapacit kolony ~300 pro 25 min, ~450 pro 45 min a až ~900 pro 205 min analýzu.
• Komparativní chromatogramy Herceptin vs. Kadcyla ukázaly kromě běžných peptidů odlišný klastr vrcholů peptid-emtansine konjugátů (25–35 min), lépe detekovaných při 252 nm.
• Pětinásobné repliky Kadcyla digestu prokázaly vynikající opakovatelnost injekcí i retenčních časů.

Přínosy a praktické využití metody

• Robustně odstraňuje šum způsobený TFA a zvyšuje citlivost detekce nízkoabundantních peptidů.
• Flexibilní nastavení gradientu umožňuje volbu mezi rychlostí analýzy a vysokým rozlišením.
• Metodu lze implementovat v QA/QC laboratořích biopharmaceutického průmyslu pro rutinní kontrolu kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace LC×LC pro ještě hlubší analýzu složitých biokonjugátů.
• Připojení hmotnostní spektrometrie pro identifikaci modifikací a posttranslačních úprav.
• Automatizace přípravy vzorků pro zvýšení throughputu a reprodukovatelnosti.

Závěr

Agilent 1290 Infinity II LC v kombinaci s AdvanceBio Peptide Map kolony a V380 Jet Weaver mixerem poskytuje vysoký rozlišení, nízký šum a vynikající opakovatelnost analýz tryptických digestů mAb a ADC. Metoda je vhodná pro detailní charakterizaci biopharmaceuticals a její flexibilita podporuje široké uplatnění v průmyslové i výzkumné praxi.

Reference

1. Sandra, K.; Vandenheede, I.; Sandra, P. Modern chromatographic and mass spectrometric techniques for protein biopharmaceutical characterization. J. Chromatogr. A 2014, 1335, 81–103.
2. Fekete, S.; et al. Chromatographic, electrophoretic, and mass spectrometric methods for the analytical characterization of protein biopharmaceuticals. Anal. Chem. 2016, 88, 480–507.
3. Huesgen, A. G. Performance of the Agilent 1290 Infinity Quaternary Pump using Trifluoroacetic Acid (TFA) as the mobile phase modifier, Agilent Technologies Technical Overview, 5990-4031EN, 2009.
4. Vanhoenacker, G.; et al. Tryptic digest analysis using the Agilent 1290 Infinity LC System, Agilent Technologies Application Note, 5990-4031EN, 2009.
5. Vanhoenacker, G.; et al. Comprehensive two-dimensional liquid chromatography of therapeutic monoclonal antibody digests, Anal. Bioanal. Chem. 2015, 407, 355–366.
6. Sandra, K.; et al. Multiple heart-cutting and comprehensive two-dimensional LC hyphenated to MS for characterization of the antibody-drug conjugate ado-trastuzumab emtansine, J. Chromatogr. B, doi:10.1016/j.jchromb.2016.04.040.