SEC Coupled to High-Resolution Mass Spectrometry for Detailed Characterization of mAbs and ADCs

Význam tématu

Charakterizace monoklonálních protilátek (mAbs) a konjugátů protilátka–lék (ADCs) je klíčová pro vývoj biologických léčiv. Metoda spojující velikostní vylučovací chromatografii (SEC) s vysokým rozlišením hmotnostní spektrometrie (HRMS) umožňuje zároveň oddělení na základě velikosti a detailní analýzu hmotnostních vlastností proteinů, jejich posttranslačních modifikací a příměsí.

Cíle a přehled studie / článku

Účelem práce je demonstrovat použití SEC/HRMS pro komplexní zkoumání intactních mAb, jejich navázaných komplexů a štěpných fragmentů po enzymatické úpravě. Studie ukazuje rozlišení agregátů, fragmentů, glykozylačních forem a distribuce náložného léku v ADCs.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika využívá:

• Agilent 1290 Infinity HPLC s Bio SEC-3 kolonkou (7,8×300 mm, 3 µm) při 1 mL/min, teplota 24 °C.
• MS-kompatibilní mobilní fáze: 20 % acetonitril, 0,1 % kyselina formová, 0,1 % kyselina trifluoroctová.
• Agilent 6540 Q-TOF LC/MS v pozitivním režimu s vysokým rozlišením (4 GHz).
• Software Agilent MassHunter pro akvizici a dekonvoluci spekter.

Pro přípravu vzorků byly použity: redukce DTT, papain, enzym IdeZ a případně Protein A pro purifikaci z buněčných supernatantů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Porovnání nevolatilního fosforečnanového pufru s MS-kompatibilní mobilní fází jednoznačně dokládá nutnost použití volatibilních složek pro čisté MS spektra bez kontaminace zdroje.
• Intaktní Herceptin dosahuje přesného měření hmotnosti cca 150 kDa s rozlišením různých glykoform (G0F, G1F, G2F) a malých fragmentů.
• Enzymatické štěpení (papain, IdeZ) umožňuje identifikaci a měření hmotností Fab, Fc, F(ab’)2 a dalších produktů s přesností do 0,005 % teoretické hmotnosti.
• Analýza ADC (Kadcyla) odhaluje distribuci počtu navázaných léčiv (DAR 0–4) a zachycuje jednotlivé formy s odchylkami pod 0,01 %.
• Vyčištění protilátky z CHO supernatantu pomocí Protein A následované SEC/HRMS ukázalo detailní rozlišení lehkých a těžkých řetězců, glykozylace a modifikací, včetně glykací.

Přínosy a praktické využití metody

Tato kombinovaná technika nabízí:

• Rychlý screening integrity mAb/ADC v jedné analýze.
• Detailní profil glykozylace a dalších PTM bez potřeby separátního odbourávání.
• Stanovení distribuce léčivých náložů v ADC pro kontrolu DAR.
• Možnost monitorování procesu výroby a kvality v QA/QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Přechod na nižší průtokové režimy (micro-/nano-LC) pro zvýšení citlivosti a snížení spotřeby vzorku.
• Vývoj SEC kolon vhodných pro analýzu v nativním stavu pro zachování nekovalentních komplexů.
• Automatizace přípravy pro vysokopropustné screeningové studie a kontrolu biosimilars.
• Integrace s pokročilými datovými platformami a AI pro zrychlení interpretace komplexních dat.

Závěr

SEC/HRMS je silný nástroj pro komplexní charakterizaci mAb a ADCs, který kombinuje velikostní separaci s detailním hmotnostním rozlišením. Metoda umožňuje rychlou a přesnou analýzu integrity, glykozylace a distribuovaných léčivých náložů v biologických léčivech.

Reference

• Sandra K., Vandenheede I., Sandra P. Modern chromatographic and mass spectrometric techniques for protein biopharmaceutical characterization. J. Chromatogr. A 2014, 1335, 81–103.
• Fekete S. et al. Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals. Anal. Chem. 2016, 88, 480–507.