PLRP-S Polymeric Reversed-Phase Column for LC/MS Separation of mAbs and ADC

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAbs) a konjugáty protilátka-lék (ADC) představují rostoucí třídu terapeutik s vysokou účinností, ale i značnou heterogenitou a citlivostí na chemické i fyzikální modifikace. Jejich detailní charakterizace je klíčová pro zajištění bezpečnosti, kvality a účinnosti léčivého přípravku. Vysoce selektivní a reprodukovatelné chromatografické metody spojené s přesnou hmotnostní spektrometrií (LC/MS) jsou v praxi nezbytné.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo ověřit výkonnost polymerní reverzněfázové kolony Agilent PLRP-S pro separaci intactních a fragmentovaných mAbs a ADC za podmínek kompatibilních s formiovou kyselinou (MS-přátelský iontový párovací činidlo). Studie porovnala rozlišení, ostrost píků a kvalitu MS spekter u různých vzorků (mAb1, mAb2, ADC).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky intactních protilátek byly analyzovány bez další úpravy v 0,1 % formiové kyselině (FA) v ACN/water a v rámci redukce (DTT), papainové a IdeS-digesce. Chromatografie probíhala na PLRP-S kolonce (2,1×50 mm, 5 µm, 1000 Å) při 80 °C a průtoku 0,6 mL/min s gradienty pro intactní a fragmentované analyty. Detekce pomocí Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF v kladném režimu ESI, rozsah m/z 600–4000 (fragmenty) a 2000–6000 (intactní).

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity LC system
• Agilent PLRP-S, 2.1×50 mm, 5 µm, 1000 Å (p/n PL 1912-1502)
• Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS se zdrojem Agilent Jet Stream

Hlavní výsledky a diskuse

Intactní analýza ukázala široce ostré piky s FWHM ≤0,1 min pro mAbs a 0,25 min pro ADC i při použití 0,1 % FA v mobile phase. Dekonvoluce spekter prokázala pět hlavních glykoforem u mAb1, čtyři u mAb2 a osm druhů vazby léčiva (D0–D8) u ADC. Fragmentovaná analýza po redukci, IdeS a papainu vedla k jasnému oddělení LC, HC, ScFc, F(ab’)2, Fc a jejich konjugovaných variant u ADC. PLRP-S zajistila vysoké rozlišení heterogenních fragmentů a vynikající citlivost MS.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Vysokou reprodukovatelnost bez silanolových a kovových interferencí
• Kompatibilitu s formiovou kyselinou pro optimální MS signál
• Širokou škálu velikostí pórů pro aplikace na makromolekuly
• Rychlou rutinní analýzu intactních i fragmentovaných mAbs a ADC

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj UHPLC sloupků s menšími částicemi pro vyšší propustnost a rozlišení. Kombinace s novými enzymy a chemickými štěpnými protokoly umožní detailnější mapování modifikací a payload distribution u komplexních ADC. Integrace s vysokorychlostní hmotnostní spektrometrií a automatizovanými workflow podpoří vysokou propustnost QC laboratoří.

Závěr

Polymerní RP kolona Agilent PLRP-S prokázala vynikající výkon při separaci intactních a fragmentovaných mAbs a ADC za MS-přátelských podmínek. Umožňuje rychlou, reprodukovatelnou a vysoce citlivou analýzu kritických vlastností biologických léčiv.

Reference

1. Beck A., Reichert J. M. Antibody-drug conjugates. mAbs 2014, 6(1):15-17.
2. McCalley D. V. Effect of buffer on peak shape of peptides in RP-HPLC. J. Chromatogr. A 2004, 1038:77-84.
3. Gudihal R., Suresh Babu C. V., Tang N. Analysis of mAb using Agilent 1290 LC coupled to 6530 Q-TOF. Application note 5991-4266EN, 2014.
4. Suresh Babu C. V. LC/MS of intact mAbs using Agilent AdvanceBio RP-mAb. Application note 5991-6296EN, 2015.
5. Gudihal R., Suresh Babu C. V., Tang N., Madhavi H. N., Uma M. Intact protein analysis on Agilent 6550 Q-TOF. App. note 5991-2116EN, 2013.
6. Martosella J., Duong P., Moyer S. Rapid UHPLC analysis of reduced mAbs on RRHD C8. App. note 5990-9631EN, 2012.