Measuring Drug-to-Antibody Ratio (DAR) for Antibody-Drug Conjugates (ADCs) with UHPLC/Q-TOF

Význam tématu

Antibody-drug conjugates (ADCs) jsou moderní terapeutické látky spojující cílené protilátky s cytotoxickými molekulami. Měření poměru vezaných léčiv k protilátce (DAR) je klíčové pro hodnocení kvality a účinnosti ADC. Optimální DAR zajišťuje rovnováhu mezi účinností a farmakokinetikou, zatímco příliš nízká či vysoká hodnota může snížit terapeutický efekt nebo zvýšit toxicitu.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo vyvinout a otestovat metodiku pro přesné určení DAR u cysteinově vázaných ADC (Adcetris) pomocí kombinace reverzní fáze UHPLC a vysokorozlišovacího Q-TOF hmotnostního analyzátoru. Studie porovnala výsledky výpočtu DAR na základě UV spektrometrie a dekonvoluce hmotnostních spekter.

Použitá metodika a instrumentace

• Systém UHPLC: Agilent 1290 Infinity II s PLRP-S kolonkou (2,1×50 mm, 5 µm, 1000 Å).
• Rozpouštědla: fáze A voda s 0,1 % kyselinou mravenčí a 0,025 % TFA, fáze B acetonitril s 0,1 % kyselinou mravenčí a 0,025 % TFA.
• Gradient a teplota: 27–95 % B v průběhu metody, kolona na 70 °C, průtok 0,25 mL/min.
• Detekce UV: 280 nm.
• MS analýza: Agilent 6530 Q-TOF s ESI+, zdrojová teplota 325 °C, plyn 7 L/min, tlak 35 psi, kapičkové napětí 3500 V, rozsah m/z 500–5000, rychlost skenování 2 spektra/s.
• Software: Agilent MassHunter BioConfirm pro dekonvoluci spekter, Agilent DAR Calculator pro výpočet DAR.

Hlavní výsledky a diskuse

• Redukcí DTT vznikaly lehké řetězce s 0–1 léčivou jednotkou a těžké řetězce s 0–3.
• Reverzní fáze UHPLC efektivně separovala komponenty, které byly identifikovány pomocí Q-TOF MS dekonvoluce.
• UV integrace relativních ploch píků pro lehký a těžký řetězec poskytla vážený průměr DAR 4,0.
• Výpočet DAR v Agilent DAR Calculator z dekonvoluovaných spekter potvrdil hodnotu DAR 4,0 shodnou s UV daty.
• RP-HPLC metoda oproti HIC nevyžaduje vysoké koncentrace solí, je kompatibilní s MS a minimalizuje kontaminaci kolony.

Přínosy a praktické využití metody

• Spolehlivá kvantifikace DAR pro kontrolu kvality ADC ve vývoji i výrobě.
• Integrace kvalitativní identifikace a kvantitativního měření v jednom experimentu.
• Minimalizace přípravy vzorků a rizika kontaminace díky kompatibilitě mobilních fází s MS.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace výpočtu DAR a integrace do online QA/QC procesů.
• Rozšíření metodiky na další typy ADC s různými linkery a terapeutickými náklady.
• Využití ion mobility spektrometrie (IM-MS) pro detailnější charakterizaci konformací ADC.
• Vývoj robustních softwarových nástrojů pro rychlé vyhodnocení distribučního profilu DAR.

Závěr

Využití RP-UHPLC spojené s Q-TOF MS a pokročilými softwarovými nástroji umožňuje rychlou a přesnou analýzu DAR u ADC. Metoda kombinuje výhody kvalitativní identifikace i kvantitativního měření v jedné platformě a představuje efektivní alternativu k tradiční HIC technice.

Reference

1. Debaene F. et al. Innovative native MS methodologies for antibody drug conjugate characterization High resolution native MS and IM-MS for average DAR and DAR distribution assessment Anal Chem 2014 86(21):10674–10683
2. Ducry L. et al. Antibody-Drug Conjugates Methods in Molecular Biology 2013 Přeloženo v Antibody conjugated drugs Science Press 2014