Structural and quantitative analysis of plant hormone and its metabolites with LC-MS/MS

Význam tématu

Indol-3-octová kyselina (IAA) je hlavní auxin v rostlinách, který reguluje růst, diferenciaci a vývoj. V rostlinných tkáních se IAA vyskytuje často v konjugované formě, jež slouží k dočasnému uložení nebo transportu hormonu a zároveň je meziproduktem jeho katabolismu. Detailní a rychlá analýza IAA a jejích metabolitů je klíčová pro porozumění hormonální regulaci a optimalizaci zemědělských postupů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout vysoce citlivou a selektivní LC-ESI-MS/MS metodu s použitím MRM pro kvantitativní stanovení řady IAA metabolitů v rostlinných vzorcích. Současně se metody využily precursor ion a neutral loss skeny ke screeningovému zjištění nových metabolitů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky z dvoutýdenních semenáčků rýže (Oryza sativa cv. Nipponbare), pěstovaných ve vodě nebo v roztoku IAA (10 µM), byly rozdělěny na nadzemní část a kořeny, homogenizovány v kapalném dusíku a extrahovány aceton-voda (4:1) s 2,5 mM diethyldithiokarbamátu. Částečná purifikace proběhla na ODS kazetové kolonce, eluát v 70 % acetonitrilu byl koncentrován a ředěn vodou před analýzou.
Instrumentace:

• UHPLC Nexera (Shimadzu) s kolonkou Cadenza CD-C18 (3 µm, 75×2 mm)
• Mobile phase A: 0,05 % kyselina octová, B: methanol, gradient 10–90 % B za 15 min, průtok 0,2 mL/min, teplota kolony 30 °C
• MS: LCMS-8030 triple quadrupole (Shimadzu), ESI pozitivní/negativní, MRM, precursor ion a neutral loss skeny
• Rychlost skenování 15 000 u/s, přepínání polarity 15 ms, dwell time 1 ms, pause time 1 ms

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila detekci a kvantifikaci deseti IAA metabolitů v koncentračním rozmezí 1–1000 nM (r > 0,999). Ve vzorcích ošetřených IAA byly všechny metabolity zvýšené, obzvláště v kořenových extraktech. Rychlé přepínání polarity a vysoká skenovací frekvence zajišťují dostatečný počet datových bodů pro přesné vyprofilování chromatografických píků. Pomocí precursor ion skenů (m/z 146+, 130+) a neutral loss skenů (161+ pro Asp konjugáty, 162– pro Glc konjugáty) bylo detekováno šest z vybraných sedmi známých metabolitů a navrženy nové kandidáty.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Simultánní kvantitativní analýzu a screening metabolitů IAA v jednom analytickém běhu
• Vysokou citlivost a reprodukovatelnost pro studium hormonálního metabolismu
• Možnost aplikace v agronomickém výzkumu, QA/QC laboratořích a průmyslové analytice

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření metody na další fytohormony, použití high-resolution MS pro potvrzení nových metabolitů, integrace s hmotnostní spektrometrií zobrazovací technikou a automatizace přípravy vzorků pro vysoký průtok.

Závěr

Popsaná LC-ESI-MS/MS metoda s rychlým MRM, precursor ion a neutral loss skenováním poskytuje komplexní a efektivní nástroj pro analýzu IAA a jejích metabolitů. Vysoká rychlost, citlivost a schopnost identifikovat nové sloučeniny otevírá možnosti pro hlubší pochopení hormonální regulace v rostlinách.

Reference

K. Kai et al., Phytochemistry, 68 (2007) 2512–2522
K. Kai et al., Phytochemistry, 68 (2007) 1651–1663