Enabling Automated, Low-Volume Plasma Metabolite Extraction with the Agilent Bravo Platform

Význam tématu

Malé objemy plasmy jsou často limitujícím faktorem u dětských nebo experimentálních vzorků. Automatizace přípravy vzorků zvyšuje reprodukovatelnost a snižuje riziko chyb při zpracování. Účinné odstraňování proteinů a lipidů při nízkém objemu je klíčové pro kvalitní analýzu metabolomů pomocí LC/Q-TOF.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem je upravit protokol automatické extrakce metabolitů na platformě Agilent Bravo tak, aby bylo možné zpracovat pouze 25 µL plasmy místo původních 100 µL. Studie hodnotí výtěžnost a reprodukovatelnost této metody pomocí LC/Q-TOF ve srovnání s manuální přípravou.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Redukce počátečního objemu plasmy na 25 µL
• Udržení poměru methanol:ethanol:plasma (225:225:100) pro efektivní precipitaci proteinů
• Quench s 1:1 MeOH:EtOH, inkubace 10 minut, přidání vody ke konečnému 50 % obsahu
• Filtrace a deplece lipidů pomocí destiček Captiva EMR—Lipid
• Sběr kompletní eluence včetně kroků wash, vysušení a rekonstituce do 100 µL vhodného roztoku pro LC/MS

Instrumentace:

• Agilent Bravo Metabolomics Sample Prep Platform
• Agilent PlateLoc thermal microplate sealer
• Agilent 1260 Infinity II Prime LC (Flex Pump, Multisampler s termostatem, Multicolumn Thermostat)
• Agilent 1200 Isocratic Pump s 100:1 splitterem
• Agilent 6546 LC/Q-TOF s Dual Jet Stream ion source
• Bravo spotřební materiál (Captiva EMR—Lipid plates, jednorázové špičky, pečeti, sběrné destičky)

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizovaná metoda dosáhla průměrné výtěžnosti 86 % a více než 80 % ze 31 testovaných metabolitů vykázalo výtěžnost vyšší než 80 %. Reprodukovatelnost (RSD) činila v průměru 4,8 % pro 60 vzorků, což je nižší než průměrné 10,3 % u manuálních příprav třemi uživateli. Metabolity ze skupin aminokyselin, organických kyselin, cukrů i nukleotidů byly spolehlivě extrahovány a detekovány.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost zpracovat vzácné nebo velmi malé objemy plasmy
• Zvýšení reproducibility a snížení variability mezi operátory
• Kompletní sběr eluátu minimalizuje ztráty při zpracování
• Integrace s LC/Q-TOF pro rychlou a robustní metabolomickou analýzu

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další miniaturizace a snížení objemů pro mikrofluidní platformy
• Automatizace pro jiné biologické matice (moč, tkáně)
• Integrace s pokročilou softwarovou analýzou a strojovým učením
• Využití v klinických studiích a personalizované medicíně

Závěr

Modifikace protokolu na platformě Agilent Bravo umožnila efektivní extrakci metabolitů z pouhých 25 µL plasmy s vysokou výtěžností a vynikající reprodukovatelností. Automatizace výrazně snižuje variabilitu a šetří vzácné vzorky.

Reference

• Automated Metabolite Extraction for Plasma using the Agilent Bravo Platform. Agilent Technologies technical overview, publication number 5994-0685, 2019.
• Discovery Metabolomics LC/MS Methods Optimized for Polar Metabolites. Agilent Technologies application note, publication number 5994-1492, 2019.