Charge Heterogeneity Analysis of Rituximab Innovator and Biosimilar mAbs

Význam tématu

Rekombinantní monoklonální protilátky (mAbs) představují klíčové bioterapeutikum s rozsáhlým využitím v diagnostice i terapii. Charakterizace jejich heterogenity elektroforetické náboje je zásadní pro zajištění účinnosti, stability a bezpečnosti, zvláště při porovnávání originálního přípravku s biosimilarem.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat profil nabíjecích variant originálního a biosimilárního rituximabu pomocí iontově výměnné chromatografie (CEX) s vysokým rozlišením. Záměrem bylo optimalizovat separační podmínky, stanovit přesnost analýzy a identifikovat varianty spojené s C-terminálními modifikacemi.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC (G5611A)
• Agilent 1260 Infinity High Performance Autosampler (G5667A)
• Agilent 1200 Infinity Series Thermostat (G1330B)
• Agilent 1260 Infinity Thermostatted Column Compartment (G1316C, option 19)
• Diode Array Detector Agilent G1315D
• Kolona Agilent Bio MAb NP5, 4.6 × 250 mm, 5 μm, PEEK (p/n 5190-2407)
• Software OpenLAB ChemStation Edition C.01.06 a Buffer Advisor Rev. A.01.01

Použitá metodika

Dva vzorky rituximabu (originál i biosimilar) byly zředěny na 1 mg/mL v čisté vodě. Metoda CEX využívala gradient chloridu sodného a fosfátového pufru pro separaci nabíjecích izoform. Detekce probíhala při 280 nm. Pro určení podílu C-terminálních lysinových variant byla provedena digesce karboxypeptidázou B (CPB) při 37 °C s následným zastavením reac e octovou kyselinou.

Hlavní výsledky a diskuse

• Separační metoda dosáhla tří odlišných skupin špiček (kyselé, hlavní forma, bazické) během 20 minut s vysokým rozlišením.
• Originální rituximab vykázal hlavní špičku s průměrným podílem 93,2 %, bazické varianty tvořily pouze 3,2 %.
• Biosimilar ukázal výrazný podíl bazických variant (~69,5 %) a hlavní forma představovala 29,8 % celkového obsahu.
• Opakovatelnost retence (RSD 0,05–0,09 %) a plochy špiček (RSD do 1,3 %) byla v akceptovatelném rozmezí.
• Digesce CPB odstranila bazické špičky, potvrzujíc, že tyto odpovídají přítomnosti C-terminálních lysinových variant.

Přínosy a praktické využití metody

Díky bio-inertnímu provedení přístroje a použití specializované PEEK kolony je metoda vysoce reprodukovatelná a citlivá. Vhodná je pro QA/QC kontrolu mAb v biofarmaceutickém vývoji i výrobě, kde umožňuje rychlou identifikaci a kvantifikaci nabíjecích heterogenit.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace a integrace s on-line softwarem pro rychlejší vývoj metod.
• Rozšíření analýzy na další mAbs a jejich glykoformy.
• Komplementární použití s hyfenovou a hmotnostní spektrometrií pro detailnější mapování PTM.
• Implementace v rámci procesního vývoje a kontinuální výroby mAb.

Závěr

Prezentovaná CEX metoda na bázi Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC a Bio MAb NP5 kolony poskytuje robustní, vysoce přesné rozlišení nabíjecích variant originálního a biosimilárního rituximabu. Digesce CPB potvrzuje identitu lysinových variant. Metoda je vhodná pro rutinní QC analýzy v biotechnologickém průmyslu.

Reference

• Yan H. et al., Journal of Separation Science 2011, 34, 548–555.
• Agilent Technologies, Application Note 5991-0895EN.
• Agilent Technologies, Application Note 5990-6844EN.
• Agilent Technologies, Application Note 5991-0565EN.