Analysis of Charge Heterogeneity in Rituximab Innovator and Biosimilar Monoclonal Antibodies Using Salt-Gradient Cation Exchange Chromatography

Význam tématu

Charakterizace nabíjecí heterogenity monoklonálních protilátek je klíčová pro hodnocení jejich biologické aktivity, stability a kvality. Charge varianty vznikají post-translačními úpravami deamidace, glykozylace či odštěpením lyzinu a mohou ovlivnit účinnost bioterapeutik.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat nabíjecí heterogenitu originálního rituximabu a jeho biosimiláru pomocí vysokoúčinné kationtové výměnné chromatografie se solným gradientem. Studie zahrnovala optimalizaci chromatografických podmínek a kvantifikaci hlavních, kyselých i zásaditých variant.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika vychází z gradientní CEX chromatografie se změnami koncentrace NaCl a pH fosfátového pufru. Pro urychlení vývoje metody byl použit software Buffer Advisor pro skautovací běhy.

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC s bio-inert pumpou, autosamplerem a detektorem bez kovových částí
• Agilent Bio MAb NP5, 4,6 × 250 mm, 5 μm, PEEK kolonka
• Mobile fáze: voda; NaCl 850 mM; NaH2PO4 41 mM; Na2HPO4 55 mM
• Detekce na 280 nm (referenční 360 nm)
• Digesce karboxypeptidázou B pro identifikaci C-terminálních lyzinových variant

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila vysoce rozlišenou separaci a kvantifikaci variant:

• Originální a biosimilární rituximab vykázaly odlišné profily kyselých i zásaditých variant s hlavním píkem tvořícím 93,2 % (originál) a 29,8 % (biosimilár)
• Přesnost retenčních časů (RSD < 0,1 %) a ploch (RSD < 1,5 %) potvrdila vysokou opakovatelnost metody
• Digesce CPB odhalila přítomnost C-terminálních lyzinových variant ve frakcích zásaditých píků

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí robustní řešení pro QA/QC v biotechnologickém průmyslu:

• Rychlý vývoj metod díky automatizovanému návrhu gradientu
• Vysoká reprodukovatelnost pro rutinní kontrolu sérií
• Možnost rozlišit jemné rozdíly mezi originálem a biosimilárem

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření hyphenace s hmotnostní spektrometrií pro detailní mapování PTM, nasazení pokročilých bio-inertních kolonek a integrace digitálních nástrojů pro automatizovanou optimalizaci pufrů.

Závěr

Salt-gradient CEX na bio-inertní LC soustavě představuje spolehlivou a reprodukovatelnou metodu pro charakterizaci nabíjecí heterogenity monoklonálních protilátek a je vhodná pro kontrolu kvality bioterapeutik.