Maximizing Phosphopeptide Recovery in LC-MS Studies with MaxPeak High Performance Surfaces Technology

Význam tématu

Analýza fosfopeptidů pomocí LC-MS je klíčová pro proteomiku i objevování biologických markerů, avšak interakce kovových povrchů chromatografických systémů s fosfátovými skupinami vede k nízké obnovitelnosti a špatnému tvaru piků. Technologie MaxPeak High Performance Surfaces (HPS) cíleně minimalizuje tyto nežádoucí interakce a znamená významný krok kupředu ve spolehlivosti a citlivosti analýz fosforylovaných peptidů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo porovnat konvenční chromatografický systém s HPS upravenou verzí (ACQUITY PREMIER) v oblasti obnovitelnosti a detekce fosfopeptidů. Jako modelové vzorky byly zvoleny tryptické digesty alfa- a beta-kaseinu a standardní syntetické směsi PhosphoMix. Studie hodnotí vliv počtu fosforylací a délky peptidů na signál a kvalitu chromatografických piků.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: tryptické digesty alfa- a beta-kaseinu; syntetické směsi PhosphoMix 1 a 3.

Chromatografie:

• LC systémy: ACQUITY UPLC I-Class (konvenční) a ACQUITY PREMIER (HPS)
• Kolony: CSH 2.1×100 mm (běžná i HPS úprava)
• Mobilní fáze: A=H2O+0.1% HCOOH, B=ACN+0.1% HCOOH
• Gradient 1–40 % B za 15 min, průtok 150 µL/min, teplota kolony 55 °C, vzorku 8 °C

Hmotnostní spektrometrie:

• MS systém: SYNAPT XS, ESI+ mód
• Režim akvizice: ToF MSE (50–2000 Da)
• Trap CE ramp 14–40 eV, kapilární napětí 2.2 kV, kužel 30 V

Software: MassLynx v4.2, PLGS 3.0.3, Skyline.

Hlavní výsledky a diskuse

HPS úprava zlepšila detekci i tvar piků fosfopeptidů bez ovlivnění nemodifikovaných peptidů. Některé peptidy nebyly v konvenčním systému vůbec detekovatelné, zatímco v HPS konfiguraci vykázaly vysoké iontové počty a ostré chromatografické píky. Efekt zesiloval se s rostoucím počtem fosforylací. Pokrytí sekvence beta-kaseinu v PLGS ukázalo výrazný nárůst identifikovaných fosforylovaných sekvencí pouze v HPS systému.

Přínosy a praktické využití metody

Ultratrvanlivá bariéra HPS:

• Odstraňuje potřebu opakované pasivace kovových cest přídavnými činidly
• Zvyšuje citlivost i pro nízko protonované fosfopeptidy
• Zlepšuje kvantitativní reprodukovatelnost v proteomických studiích

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření HPS povrchů na další třídy kovových komponent LC-MS by mohlo vést k univerzálnímu zvýšení výkonu pro široké spektrum polarizovaných analytů. Integrace s novými iontovými zdroji a rozšířenými režimy fragmentace může dále zlepšit identifikaci a kvantifikaci posttranslačních modifikací.

Závěr

MaxPeak HPS technologie zásadně zvyšuje obnovitelnost fosfopeptidů v LC-MS analýzách, odstraňuje ztráty v kovových kapalinových cestách a přináší ostřejší, citlivější a spolehlivější data. Tato inovace posouvá hranice kvalitativních a kvantitativních proteomických aplikací.

Reference

1. Liu X. et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005;19(19):2747–2756.
2. Winter D.J. et al. J. Proteome Res. 2009;8(1):418–424.