Simplified molecular imaging analysis of excreted microbial metabolites using a benchtop MALDI-TOF system

Význam tématu

Biofilmy jsou klíčovým faktorem v množství chronických bakteriálních infekcí a jejich metabolity, jako jsou quorum sensing molekuly či rhamnolipidy, slouží jako důležité biomarkery. Využití zobrazovacích metod přináší prostorové informace o produkci těchto látek přímo v místě růstu mikrobiálních kolonií. Doteď byla taková analýza omezena na drahé špičkové MALDI-TOF přístroje.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo otestovat benchtop lineární MALDI-TOF hmotnostní spektrometr dostupný v laboratořích s menším rozpočtem, zmapovat prostorové rozložení exo-metabolitů u mono- a polymikrobiálních biofilmů Pseudomonas aeruginosa a demonstrovat synergii s LESA-MS metodikou poskytující vysokou přesnost hmotnosti a MS/MS rozlišení.

Použitá metodika

Vzorky se připravovaly na MALDI MS podkladech s tenkou vrstvou agaru na Fleximass-DS slides. Po inokulaci disků s mikroby a 24hodinové inkubaci se na plochu nanesl 9-aminoakridinát pomocí iMLayer sublimátoru. Snímání probíhalo v negativním iontovém módu s masovým oknem ±0,4 Da. Pro doplňkovou analýzu byly sekrety extrahovány LESA přístupem s 1:1 methanol:voda pro QS molekuly a 2:1 chloroform:methanol pro lipidy.

Použitá instrumentace

• Benchtop MALDI-8030 dual polarity MALDI-TOF (Shimadzu)
• iMLayer™ automated matrix sublimation device (Shimadzu)
• Fleximass-DS MALDI target slides
• LESA elektrosprayové rozhraní (Advion LESA)
• Orbitrap Exactive / Q Exactive pro MS a MS/MS (Thermo)

Hlavní výsledky a diskuse

MALDI obrazce ukázaly homogenní distribuci quorum sensing molekul (HHQ, NHQ, PQS) a rhamnolipidů pod biofilmem P. aeruginosa. Při společné kultivaci se Staphylococcus aureus nebo Candida albicans docházelo k významnému snížení signálu většiny látek, s výjimkou HHQ, která byla v přítomnosti SA zvýšená. LESA-MS potvrdila tyto trendy s vysokou přesností hmotnosti a MS/MS spektry umožnily potvrdit strukturu klíčových iontů.

Přínosy a praktické využití metody

• Finančně dostupná platforma pro prostorovou analýzu mikrobiálních metabolitů
• Rychlá vizualizace rozložení biomarkerů přímo na biofilmu
• Komplementarita MALDI imagingu a LESA-MS pro kvantifikaci a strukturální ověření
• Uplatnění v klinické diagnostice, farmaceutickém výzkumu a QA/QC v průmyslu

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření na komplexní mikrobiální komunity a environmentální vzorky, integrace s vysokorozlišovacími technikami IMS, 3D elektronovou tomografií a real-time monitoringem. Dále je perspektivní spojení s genomickými a proteomickými daty pro holistický pohled na biofilmovou dynamiku.

Závěr

Studie prokázala, že benchtop MALDI-TOF zařízení dokáže spolehlivě zobrazit exo-metabolity mikrobiálních biofilmů a ve spojení s LESA-MS poskytuje komplexní prostorové i strukturální informace. To otevírá nové možnosti pro dostupnou a efektivní analýzu biomarkerů.

Reference

• Jamal M., et al. Journal of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 2018.
• Barr H.L., et al. European Respiratory Journal, 2015.
• Robertson S., et al. Analytical Chemistry, 2023.
• Michelsen C.F., et al. ISME Journal, 2016.