Lab-Scale Oligonucleotide Purification Using Waters Fraction Manager — Analytical System

Význam tématu

Proces syntézy oligonukleotidů generuje vedlejší produkty a neúplné sekvence které mohou negativně ovlivnit účinnost a bezpečnost výsledného léčiva. Pro terapeutické aplikace, například siRNA, je nezbytné zajistit vysokou čistotu a správnou identitu molekul.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo předvést použitelnost systému Waters Fraction Manager – Analytical (WFM-A) jako analytického řešení pro izolaci a obohacení terapeutických oligonukleotidů od nečistot vznikajících v průběhu syntézy. Studie ukazuje integraci WFM-A do stávajících UPLC platforem a automatizovaný sběr frakcí.

Použitá instrumentace

• Systém Waters Fraction Manager – Analytical integrovaný s UPLC H-Class
• Řídicí software Waters Empower pro programování sběru frakcí
• ACQUITY OST BEH C18 kolona 130 Å, 1,7 µm, 2,1 × 50 mm

Použitá metodika

Vzorek komerčně syntetizované 21-mer siRNA (sekvence 5 TTCCUUGUAAUCGCUUGACGA 3 ) o množství 1 nmol byl separován pomocí gradientu od 5 do 13 procent fáze B během 10 minut. Frakce obsahující cílový oligonukleotid byly automaticky vybírány na základě časového okna mezi 9,16 a 9,76 minutou za dva po sobě jdoucí vstřiky. Sběrné frakce byly vysušeny vakuovou centrifugou a rekonstituovány ve stejném objemu jako výchozí vzorek.

Hlavní výsledky a diskuse

Systém WFM-A zvýšil čistotu cílového 21-meru po purifikaci z přibližně 81 procent na více než 97 procent při zachování objemu a hmotnostní koncentrace. Výsledky ukazují vysokou účinnost separace s minimálními ztrátami a nízkou mírou carry-over mezi frakcemi.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analytická purifikace terapeutických oligonukleotidů pro preklinické i výzkumné účely
• Vysoká čistota vhodná pro experimenty siRNA a další biologické aplikace
• Minimalizace ztrát a zkrácení doby přípravy vzorku

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalšími směry vývoje jsou zvýšení kapacity frakcionace pro vyšší throughput, integrace online detekce vysokého rozlišení a využití inteligentních algoritmů pro řízení sběru frakcí. Rozšíření technologie na jiné biomolekuly, jako jsou peptidy či glykoproteiny, může zvýšit univerzálnost platformy.

Závěr

Systém Waters Fraction Manager – Analytical prokázal efektivní a snadno integrovatelné řešení pro analytickou purifikaci terapeutických oligonukleotidů s vysokou čistotou a výtěžností. Nabízí praktický nástroj pro laboratorní workflow v oblasti QA QC a preklinického výzkumu.

Reference

1. McCarthy S., Gilar M., Gebler J. Reversed-phase ion-pair liquid chromatography analysis and purification of small interfering RNA. Analytical Biochemistry 2009; 390 181-188.
2. Birdsall R., Yu YQ. High-throughput screening of oligonucleotides for identity and purity assessment using the ACQUITY QDa Detector and ProMass for MassLynx. Waters Corporation 2016.
3. Aubin A., Jablonski J. Small scale peptide and impurity isolation using the ACQUITY UPLC H-Class and Waters Fraction Manager – Analytical Systems. Waters Corporation 2015.