Accurate Bioanalytical Peptide Quantification of Salmon Calcitonin Using High Resolution Mass Spectrometry (HRMS)

Význam tématu

V oblasti bioanalytické chemie je přesná a citlivá kvantifikace peptidů kritická pro výzkum farmaceutických látek a klinické aplikace. S rostoucím zájmem o bioterapie vyvstává potřeba metod s vysokou selektivitou, dynamickým rozsahem a schopností poskytovat jak kvantitativní, tak kvalitativní data. Vysoce rozlišená hmotnostní spektrometrie (HRMS) nabízí tyto vlastnosti a je proto perspektivní alternativou ke klasickým tandemovým kvadrupólovým metodám.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit výkon spektrometru Xevo G2-XS QTof v kvantifikaci salmon kalcitoninu extrahovaného ze séra v porovnání s osvědčeným Xevo TQ-XS Tandem Quadrupole. Studie se zaměřila na dosažení nízkého limitu kvantifikace (LLOQ), vysoké přesnosti a reprodukovatelnosti při nízkém objemu vzorku (100 µL séra).

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byla použita jednoduchá extrakce na pevné fázi (mixed-mode SPE). Chromatografické rozdělení proběhlo na ACQUITY UPLC s kolonkou CORTECS UPLC C18+ (90 Å, 1,6 µm, 2,1 × 50 mm) při gradientu 5–75 % B během 4,5 min (formaic acid v 0,1 % a acetonitril, průtok 0,4 mL/min). HRMS detekce využila Xevo G2-XS QTof ve třech režimech: full scan, ToF-MRM (překurzor > překurzor) s Target Enhancement (TE) a ToF-MRM (překurzor > produkt) s TE. Pro srovnání byl použit Xevo TQ-XS v módu MRM (překurzor > produkt).

Hlavní výsledky a diskuse

V režimu ToF-MRM (překurzor > překurzor) s velmi nízkou kolizní energií byly identifikovány formy 4+ (m/z 859,146) a 5+ (m/z 687,911). Při extrakci úzkého masového okna 20 mDa došlo k výraznému zvýšení poměru signál/šum (S/N > 25) a potlačení endogenních interferencí. Kalibrační křivky pro rozsah 50–1 500 pg/mL vykázaly linearitu (r2 > 0,99, vážení 1/x) a přesnost v rozmezí 85–110 %. LLOQ dosáhl 50 pg/mL, reprodukovatelnost (CV) byla pod 10 % a průměrná přesnost kvalitativních kontrol (QC) mezi 86–108 %. Výsledky byly srovnatelné s výkonem Xevo TQ-XS, přičemž HRMS nabídlo lepší selektivitu díky vysoké přesnosti hmotnosti.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje citlivé a spolehlivé měření peptidu salmon kalcitoninu ze vzorku lidského séra s nízkým objemem vzorku a krátkou analýzou. Využití HRMS ve formě ToF-MRM s TE přináší:

• vysokou selektivitu díky úzkému masovému oknu,
• široký dynamický rozsah a možnost retrospektivní analýzy,
• porovnatelnou citlivost s tandemovými kvadrupóly,
• získání kvalitativních dat pro identifikaci peptidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší nasazení HRMS pro bioanalytiku větších a komplexnějších biomolekul. Mezi perspektivní směry patří:

• multianalyzové kvantifikace peptidů a proteinů v jednom běhu,
• integrace kvalifikačních a kvantifikačních dat,
• pokročilá datová analýza s využitím strojového učení,
• microflow a ultrarychlá chromatografie pro zkrácení doby analýzy a zvýšení propustnosti.

Závěr

Studie prokázala, že Xevo G2-XS QTof v režimu ToF-MRM s Target Enhancement poskytuje vysoce citlivou, přesnou a reprodukovatelnou kvantifikaci salmon kalcitoninu ze séra s LLOQ 50 pg/mL. Výkon je srovnatelný s konvenčními triple-quad metodami, přičemž navíc nabízí lepší selektivitu a možnost sběru doplňujících kvalitativních dat.

Reference

• Waters Application Note 720006342EN: Extrakce salmon kalcitoninu ze séra metodou SPE.
• Waters Application Note 720006382EN: Kvantifikace salmon kalcitoninu pomocí Xevo G2-XS QTof MS.