Determination of Catecholamines by Agilent Ultivo LC/TQ with an InfinityLab Poroshell 120 Aq‑C18 Column

Význam tématu

Catecholaminy představují klíčové neurotransmitery a regulační molekuly v nervovém, oběhovém a endokrinním systému. Jejich spolehlivé stanovení na úrovni pikogramů v biologických maticích je zásadní pro výzkum patofyziologie, klinickou diagnostiku a farmakokinetické studie. Vyžaduje se metoda s vysokou citlivostí, selektivitou a reprodukovatelností pro snadnou implementaci v laboratořích QA/QC i výzkumných institucích.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a validovat kvantifikační LC-MS/MS metodiku pro šesti catecholaminy (3-MT, DA, E, NE, MN, NMN) v 1% BSA matici s nízkým limitem detekce a širokým lineárním rozsahem. Metoda využívá Agilent Ultivo LC/TQ systém a novou kolonu InfinityLab Poroshell 120 Aq-C18 pro dosažení baseline separace a vynikající výtěžnosti analýzy.

Použitá metodika

Na přípravu standardních řešení byla použita 0,1% kyselina mravenčí ve vodě. Z matice 1% BSA (s 0,1% formiové kyseliny a 25 mg/mL kyseliny citronové) se připravily pracovní standardy v koncentracích 5–500 pg/mL (epinefrin 10–500 pg/mL). Vzorky se obohatily o izotopově značené interní standardy (10 ng/mL), proteiny se srážely 10% TCA, poté se centrifugovalo a supernatant se přímo injektoval.

Podmínky chromatografie:

• Kolona InfinityLab Poroshell 120 Aq-C18, 4,6 × 100 mm, 2,7 µm
• Mobilní fáze A: 10 mmol NH4Ac + 0,25 mmol NH4F ve vodě, B: acetonitril
• Gradient 98 % A → 5 % A v průběhu 7 min, flow 0,5 mL/min, teplota 40 °C, objem injekce 25 µL

MS/MS podmínky: poz. ionizace AJS+, MRM přechody pro každý analyte, kapilární napětí 2000 V, N2 proudy 5 L/min (drying) a 11 L/min (sheath), teploty 180 °C/370 °C.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity II LC (binary pump K7112B, autosampler K7167A, kolonna compartment K7116A)
• Agilent Ultivo LC/TQ s Jet Stream Technology ion source (AJS+)
• InfinityLab Poroshell 120 Aq-C18, 4,6 × 100 mm, 2,7 µm
• Chlazená centrifuga (≥ 12 000 × g)
• Vortex mixer

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatogram ukázal baseline separaci všech šesti catecholaminů s ostrými, symetrickými píky. Lineární rozsah byl 5–500 pg/mL (epinefrin 10–500 pg/mL) s koeficientem determinace R2 > 0,996. Obnova spikovaných vzorků dosahovala 80–120 %. Parametry MRM zajišťují vysokou selektivitu a potlačení matrice. Opakovatelnost retencí i kvantitativních odpovědí byla vynikající.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Extrémně nízké limity detekce v komplexních maticích
• Rychlou analýzu (< 10 min gradient)
• Jednoduchou přípravu vzorků a robustní zpracování
• Přímou aplikaci v klinickém výzkumu, diagnostice a farmakokinetice

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Rozšíření na další vysoce polární biomolekuly
• Integrace s high-throughput platformami pro screening
• Automatizace přípravy vzorků a online SPE
• Adaptace pro mikroprůtokové a nano-LC systémy

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda s Agilent Ultivo LC/TQ a Poroshell 120 Aq-C18 kolonnou prokázala vysokou citlivost, selektivitu a reprodukovatelnost v analýze catecholaminů v BSA matrix. Široký lineární rozsah a vynikající obnova dávají metodě potenciál širokého uplatnění v klinických a výzkumných laboratořích.

Reference

1. Fu R-J, Wei T-C. Analysis of Polar Compounds Using an Agilent InfinityLab Poroshell 120 Aq-C18 Column with Improved and Reliable Performance. Agilent Technologies Application Note, publication number 5994-5555EN, 2022.