Robust Automated High-Throughput N-Glycan Analysis Using the GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Kit for Automation

Význam tématu

Glykanová analýza je klíčová pro charakterizaci glykoproteinů v biomedicíně, farmaceutickém výzkumu a kvalitativní kontrole biotechnologických produktů. Vysoká prostupnost a reprodukovatelnost N-glykanových profilů pomáhají v optimalizaci výrobních procesů, porozumění biologické aktivitě a zajištění shody s regulačními požadavky.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit robustnost a přesnost plně automatizovaného pracovního postupu pro přípravu N-glykanů pomocí GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Kit - Automation a robotické platformy Tecan. Studie porovnává výkon, rychlost a reprodukovatelnost automatizovaného řešení oproti manuální přípravě vzorků a hodnotí dopad klíčových parametrů na kvalitu analytických dat.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC I-Class nebo H-Class Bio se základním modulem FLR detektoru
• ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide kolona (130Å, 1.7 µm, 2.1×150 mm)
• GlycoWorks HILIC µElution 96-well deska
• Tecan EVO Freedom 100 s Teleshake modulem
• RapiFluor-MS N-Glycan Kit - Automation
• RapiGest SF Surfactant, RapiFluor-MS Glycan Performance Test Standard, Intact mAb Mass Check Standard

Použitá metodika

Vzorky glykoproteinů jsou denaturovány v přítomnosti RapiGest SF při 90 °C po dobu 3 min, poté probíhá deglycosylace PNGase F při 50 °C po dobu 5 min. Uvolněné glykozylaminy jsou značené RapiFluor-MS činidlem, po čemž následuje HILIC SPE čistící krok. Automatizace využívá pevné pipetovací objemy 10 µl, Teleshake pro míchání a standardizovaný Tecan skript umožňující skenování vzorků, normalizaci koncentrace a postupné zpracování až 96 vzorků do 3 h. Analýza probíhá UPLC HILIC metodou s 55 min gradientem a fluorescenční detekcí Ex 265/Em 425 nm.

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizovaná příprava vzorků poskytuje ekvivalentní N-glykanové profily (G0F, G1Fa, G1Fb, G2F) oproti manuální metodě s rozdílem menším než 5 % a precizitou pod 3 % CV. Metoda prokázala robustnost při změnách teploty, koncentrace RapiGest SF, mixovacích parametrů, SPE eluce a expozici reagencií na worktable bez významného vlivu na výsledky. Vzorky jsou stabilní až 88 h při 10 °C v autosampleru bez zhoršení analytické kvality.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší propustnost: 96 vzorků do 3 h bez zásahu obsluhy
• Snížení chybovosti a zvýšení reprodukovatelnosti díky standardizaci skriptu
• Srovnatelná kvalita dat s manuálním postupem
• Flexibilita pro různé glykoproteiny a adaptace na další automatizační platformy

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší implementace plně automatizovaných glykanových workflow v QC a vývoji bioterapeutik, integrace s LIMS a rozšíření na rychlejší chromatografické metody. Dále se předpokládá rozvoj multi-reaction zpracování, multiplexního značení a rozšíření kompatibility s pokročilými MS detektory pro komplexní glycome analýzu.

Závěr

GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Kit - Automation na platformě Tecan představuje robustní, rychlé a reprodukovatelné řešení pro vysoce propustnou N-glykanovou analýzu. Automatizace minimalizuje lidskou chybu, zkracuje čas přípravy a udržuje vysokou kvalitu dat, porovnatelnou s manuálními postupy.

Reference

1. Lauber M.A. et al., Robustness of RapiFluor-MS N-Glycan Sample Preparations and Glycan BEH Amide HILIC Chromatographic Separations, Waters Application Note 720005370EN 2015.
2. Lauber M.A. et al., GlycoWorks HILIC SPE Robust Glycan Sample Preparation, Waters Application Note 720005116EN 2014.
3. Koza S.M. et al., Quality Control and Automation Friendly GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Sample Preparation, Waters Application Note 720005506EN 2016.
4. Lauber M.A. et al., Rapid Preparation of Released N-glycans for HILIC Analysis Using a Labeling Reagent that Facilitates Sensitive Fluorescence and ESI-MS Detection, Analytical Chemistry, 2015, 97, 5401–5409.
5. Fournier J.L., A Review of Glycan Analysis Requirements, Biopharm International, Vol. 28, Issue 10, p. 32–37.
6. ICH Guidance for Industry Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology, 1996.
7. USP <1225> Validation of Compendial Procedures.
8. FDA Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, 2015.